實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)基的配制及細(xì)胞培養(yǎng)的條件

一、培養(yǎng)基的特性－細(xì)胞生存的環(huán)境與條件
1溫度條件（37 ＋0.5）
2 pH條件 （7.2-7.4）
3氣體條件
4水的質(zhì)量（三蒸）
5滲透壓
6營(yíng)養(yǎng)條件
7無(wú)菌條件℃
二、 培養(yǎng)基的分類(lèi)
1平衡鹽液
2天然培養(yǎng)基（小牛血清、胚胎液）
3合成培養(yǎng)基（化學(xué)成分清楚）
三、 RPMI1640培養(yǎng)基的配制
1、RPMI1640 10 g
2、丙酮酸鈉 0.11 g
3、Hepes（羥乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g
4、NaHCO3  2 g
5、三蒸水 1000 mL
四、 過(guò)濾出菌
    儀器：不銹鋼正壓濾器
    材料：纖維素微孔慮膜 （0.22 mm 孔徑）
裝好后消毒
五、 完全培養(yǎng)基的配制
RPMI 1640 培養(yǎng)液   85 mL
小牛血清             10 mL
谷氨酰氨             1 mL
抗菌素（青、鏈霉素） 1萬(wàn)單位 1 mL

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)（SP2/0細(xì)胞）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br /> 1、為細(xì)胞融合準(zhǔn)備SP²/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞；
2、雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)（種腹水），或傳代培養(yǎng)。
二、實(shí)驗(yàn)原理：
小鼠骨髓效力細(xì)胞株（NSI，SP₂/0）和雜交瘤細(xì)胞均具有無(wú)限生長(zhǎng)繁殖的能力，它們都屬于半貼壁細(xì)胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需輕輕沖洗瓶壁上的細(xì)胞便可脫落。因而可以利用這些特性對(duì)這類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，以為實(shí)驗(yàn)提供生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞）。
三、實(shí)驗(yàn)材料：
SP²/0細(xì)胞（或雜交瘤細(xì)胞）
CO₂培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25、50、100毫升）、彎頭滴管、消毒用套筒（玻璃或銅質(zhì)）、吸頭、RPMI-1640完全培養(yǎng)基、倒置顯微鏡、試管架、酒精燈、滅菌高壓鍋。
四、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、復(fù)蘇的或轉(zhuǎn)瓶的傳代細(xì)胞，使細(xì)胞濃度大約為5×10⁴/毫升，置37℃5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)48小時(shí)后，可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，而部分細(xì)胞呈漂浮狀態(tài)，可用滴管吸去漂浮的細(xì)胞，加入少量新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)以上。
3、若細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，則需及時(shí)沖下并吸出部分細(xì)胞，或?qū)⑽龅募?xì)胞轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，如果不是這樣處理，細(xì)胞很易出現(xiàn)衰老、死亡現(xiàn)象，對(duì)于雜交瘤來(lái)講，這樣更易誘發(fā)陽(yáng)性克隆丟失可能性。
4、用于細(xì)胞融合的骨髓細(xì)胞，必須在生長(zhǎng)繁殖的對(duì)數(shù)期（約10⁵細(xì)胞/毫升），而且細(xì)胞形態(tài)規(guī)則要一致（圓而亮，有一定的立體感），機(jī)能要活躍，活細(xì)胞數(shù)在90—95%以上。要得到這種細(xì)胞，其培養(yǎng)技巧在于，在融合前24小時(shí)，將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞全部自瓶壁沖下來(lái)，并除去1/2或更多的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液令細(xì)胞重新貼壁分裂增繁。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5、作為長(zhǎng)期在體外傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，為減少工作量，可采用8—10%小牛血清的培養(yǎng)基，這樣細(xì)胞的繁殖速度亦慢，一般可間隔3天更換一次培養(yǎng)液。
6、本試驗(yàn)要求各組將細(xì)胞自小瓶轉(zhuǎn)入中瓶再轉(zhuǎn)入較大的培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)，并用對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞用于凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)六）。
五、結(jié)果觀察：
1、細(xì)胞傳代前后的生長(zhǎng)狀態(tài)及速度的觀察；
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶后生長(zhǎng)情況觀察；
3、了解生長(zhǎng)良好，一般及較差細(xì)胞的顯微鏡下觀察；
4、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的體會(huì)。
六、注意事項(xiàng)：
1、連續(xù)細(xì)胞傳代培養(yǎng)更應(yīng)注意無(wú)菌操作；
2、傳代時(shí)機(jī)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況及速度十分重要，尤其要注意不能等細(xì)胞出現(xiàn)老化后再傳代，那樣做一般結(jié)果并不如愿；
3、傳代轉(zhuǎn)瓶時(shí)細(xì)胞量的取舍主要根據(jù)細(xì)胞量的多少，生長(zhǎng)條件優(yōu)劣以及個(gè)人實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)而決定；
4、用于凍存、融合、傳代的細(xì)胞都要求是處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，不能勉強(qiáng) 為之。
 

實(shí)驗(yàn)   淋巴細(xì)胞雜交瘤的制備

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、系統(tǒng)了解淋巴細(xì)胞雜交瘤實(shí)驗(yàn)技術(shù)的全部過(guò)程；
2、學(xué)會(huì)觀察與判別融合細(xì)胞的出現(xiàn)，并計(jì)算融合率。
二、實(shí)驗(yàn)原理：
小鼠骨髓瘤可以在體外培養(yǎng)液中生存并大量繁殖。經(jīng)過(guò)用某種抗原免疫的小鼠及淋巴細(xì)胞能分泌某種抗體，但小鼠的B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)某中不易存活。
如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌霜種抗體的B淋巴細(xì)胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下產(chǎn)生融合，則融合的細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，在HAT選擇培養(yǎng)基中可以選擇得到雜交細(xì)胞。這種融合的被稱(chēng)為淋巴細(xì)胞雜交瘤的細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)液中大量繁殖生長(zhǎng)，從培養(yǎng)液上清中可以收集到大量某B淋巴細(xì)胞產(chǎn)物——單克隆抗體。
三、實(shí)驗(yàn)材料：
免疫的BALB/小鼠，SP2/O骨髓瘤細(xì)胞株，CO₂培養(yǎng)箱
超凈工作臺(tái)  倒置顯微鏡  光學(xué)顯微鏡   恒溫水箱
計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、蓋玻片；  離心機(jī)  手提式自封消毒鍋  彎頭滴管
吸量管（1.0、0、5.0毫升） 注射器（5毫升，10毫升）  針頭（7^#）
細(xì)胞培養(yǎng)瓶  24孔、96孔培養(yǎng)板（天津產(chǎn)或進(jìn)口） 酒精燈
120目鋼絲網(wǎng)
￠9cm平皿
50ml帶蓋塑料離心管
100毫升三角瓶、青毒素小瓶
燒杯（100，500，1000毫升）
微濾器1000毫升正壓不銹鋼濾器
微孔濾膜
眼科剪、鑷
脫脂棉、紗布、膠布、衛(wèi)生卷紙
HAT培養(yǎng)基
HT培養(yǎng)基
無(wú)血清培養(yǎng)基
15%小牛血清培養(yǎng)基
小牛血清
乙醇（AR，工業(yè)純）
C—PBS
四、培養(yǎng)基與試劑的配制：
1、RPMI-1640培養(yǎng)基的配制；
RPMI-1640粉 10.4g
丙酮酸鈉 0.11g
Hepes 5.925g
三蒸水 1000ml
磁力攪攔器攪攔3小時(shí)，溶解后過(guò)濾除菌，在4℃中保存。
2、200mML-谷氨酰胺的配制：
L-谷氨酰胺 1.461g
三蒸水 100ml
深解后，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，每瓶1ml，在-20℃保存。
4.5%碳酸氫鈉（N_aHCO₃）配制
N_aHCO₃ 5g
三蒸水 100ml
8磅高壓滅菌15分鐘，在4℃保存。如分裝小瓶，每瓶4.2ml。
5、次黃嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT）100倍母液配制：
次黃嘌呤（Hypoxanthine，H）68.05mg
胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T） 19.4mg
三蒸水 50ml
在45—50℃水浴中溶解，過(guò)濾除菌，分裝小試管中，每管1—5ml，在-20℃保存。
6、氨基碟呤（A）1.76mg
三蒸水 90ml
IN氫氧化鈉 0.5ml
溶解后，加入IN鹽酸0.5ml中和，補(bǔ)充蒸餾水**100ml
過(guò)濾除菌，分裝小試管內(nèi)，每管1—5ml，在-20℃保存。
7、無(wú)血清RPMI-1640 100ml
L-谷氨酰胺200nM（0.2） 1.0ml
抗菌素（青、鏈霉素各1萬(wàn)單位） 1.0ml
5%碳酸氫鈉 4.2ml
8、RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制
RPMI-1640完全培養(yǎng)液 100ml
L-谷氨酰胺200mM（0.2m） 1.0ml
青、鏈霉素（各1萬(wàn)單位/ml） 1.0ml
5%碳酸鈉 4.2ml
小牛血清（滅活） 15ml
9、HAT培養(yǎng)基的配制：
RPMI-1640完全培養(yǎng)基 100ml
100倍HT母液 1.0ml
100倍A母液 0.8ml
10、HT培養(yǎng)基的配制
RPMI-1640完全培養(yǎng)基 100ml
100倍HT母液 1.0ml
11、50%（W/V）聚乙二醇（PEG）液的配制
PEG 10.0g
8磅15分鐘，或煮沸20分鐘滅菌并且融化，冷**50℃時(shí)加入。
RPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)基 10ml
混合均勻，分裝小試管內(nèi)，每管0.7ml，在-4℃中保存。
12、0.15MPH7.2枸櫞酸鈉-PBS配制：
NaCI 6.4g   KCI 0.16g  NaHPO₄·H₂O 2.32g   KH₂PO₄ 0.16g
枸櫞酸鈉 7.6g  二蒸水 1000ml
分裝在100ml瓶中，每瓶50—100ml，8磅15分鐘高壓滅菌后，在4℃保存。
13、20%二甲基亞礬（DMSO）細(xì)胞保存液的配制（按體積計(jì)算）：
小胎牛血清 5份
RPMI完全培養(yǎng)基 3份
二甲基亞礬（DMAO） 2份
混勻，在4℃保存，不必過(guò)濾除菌或高壓清毒二甲亞礬，因它也是有毒的以**于自身是無(wú)菌的。
14、8-氮鳥(niǎo)嘌呤100倍母液的配制
8-氮鳥(niǎo)嘌呤 1 152mg#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
0.36%NaHCO₂ 1.0ml
4N NaOH 100ml
三蒸水 100ml
過(guò)濾除菌，分裝小瓶，每瓶1.0ml，在-40℃保存。
15、0.1%伊文氏蘭液配制：
伊文氏蘭液（Fveng’s blue） 0.1g
0.15M PH7.2枸楷酸鈉-PBS 100ml
混勻，4℃保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀釋成0.1%。
五、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、取末次免疫后的第3天小鼠脾細(xì)胞懸液，將10⁸小鼠脾細(xì)胞與1-5×10⁷SO₂/O小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合于50毫升刻度離心管中，經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分離心7分鐘；
2、棄上清液，盡可能除得干凈，用手指輕叩離心管底部，使沉淀混勻如糊狀，離心管置37℃水中進(jìn)行水?。ㄒ恍校?，準(zhǔn)備融合；
3、將37℃水浴中保溫的50%PEG1.0毫升（實(shí)際應(yīng)用0.7毫升）用滴管緩慢滴入離心管中，在60秒鐘內(nèi)滴完，在37℃水浴中邊滴邊搖邊離心管，使細(xì)胞保存在混勻狀態(tài)；
4、加完P(guān)EG后，將細(xì)胞懸液放在37℃水浴中靜置90秒鐘，立即在2—4分鐘內(nèi)加入15毫升無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（37℃），開(kāi)始要一滴一滴地加，由于稀釋使PEG停止作用。注意盡可能不攪動(dòng)細(xì)胞；
5、再經(jīng)100轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。棄去上清液，加25毫升HAT培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混懸液分裝已有巨噬細(xì)胞的兩個(gè)24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5毫升；
6、將培養(yǎng)板放在水蒸汽飽和CO₂孵箱中，37℃孵育。CO₂含量為5%；
7、每2—3天換一次HAT培養(yǎng)液，連續(xù)2周觀察雜交瘤細(xì)胞是否出現(xiàn)。2周后使用HT培養(yǎng)基。
六、注意事項(xiàng)：
1、細(xì)胞雜交瘤的實(shí)驗(yàn)全過(guò)程必須是在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的疏忽均可導(dǎo)致嚴(yán)重污染。因而須嚴(yán)格的無(wú)菌操作。
2、試劑價(jià)格相對(duì)昂貴，應(yīng)注意節(jié)省。
3、試驗(yàn)中的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是結(jié)細(xì)胞融合過(guò)程和細(xì)胞克隆的篩選工作更為重視。

實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞克隆化培養(yǎng)技術(shù)—有限稀釋法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br /> 1、掌握用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆化培養(yǎng)技術(shù)；
2、學(xué)會(huì)細(xì)胞克隆形成的辯觀察技能；
3、配合抗體分泌細(xì)胞篩選技術(shù)，確定抗體分泌細(xì)胞。
二、實(shí)驗(yàn)原理：
克隆化培養(yǎng)即單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)，可以及時(shí)確定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，同時(shí)淘汰因發(fā)生染色體丟失或抗體的輕、重鏈基因分離而出現(xiàn)無(wú)抗體分泌陰性細(xì)胞株。
一般雜交瘤細(xì)胞需經(jīng)過(guò)52—3次反復(fù)克隆后，才能達(dá)到100%細(xì)胞陽(yáng)性率。
該辦法亦適用于一般細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞純化、突變細(xì)胞株的選擇，識(shí)別和分離。是細(xì)胞株的常用方法。
三、實(shí)驗(yàn)材料：
雜交瘤細(xì)胞、25毫升培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（天津有機(jī)玻璃廠）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、彎頭滴管、倒置顯微鏡、CO₂培養(yǎng)箱、白細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、蓋玻片、防水筆、RPMI-1640、小牛血清、青鏈霉素、10毫升刻度離心管，00橡膠塞，飼養(yǎng)細(xì)胞（3-6×10⁵/ml、見(jiàn)腹腔細(xì)胞的制備）。
四、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、分裝了每孔0.1毫升腹腔細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（可提前24小時(shí)準(zhǔn)備就緒，置CO₂培養(yǎng)箱中備用）；
2、自細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收集長(zhǎng)勢(shì)良好的雜交瘤細(xì)胞（亦可自24孔培養(yǎng)板孔中收集），制成懸液。
3、按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)確計(jì)得細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)，一般在10⁵/毫升左右。
4、取3支10毫升刻度離心管排列在超凈工作臺(tái)試管架上，先用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋**10³/毫升，再用含15%小牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋到10¹/毫升細(xì)胞，即每0.1毫升1個(gè)細(xì)胞。
5、每孔0.1毫升細(xì)胞懸液。
6、置37℃5%CO₂培養(yǎng)箱，4天后取出觀察，并在板蓋上打上標(biāo)記，做好記錄并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
7、繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，則在第4-5天更換1/2培養(yǎng)基，約第7-9天可以收獲培養(yǎng)液上清用于檢測(cè)抗體。并重復(fù)檢測(cè)1-2次。
8、選擇單克隆生長(zhǎng)孔，生長(zhǎng)良好，陽(yáng)性強(qiáng)者，轉(zhuǎn)移到24孔板再做克隆經(jīng)培養(yǎng)或擴(kuò)大培養(yǎng)。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總細(xì)胞孔（如96孔）中出現(xiàn)克隆孔統(tǒng)計(jì)出克隆百分率，并可進(jìn)一步按單細(xì)胞孔、雙細(xì)胞孔、多細(xì)胞孔分別計(jì)算出百分率。
六、注意事項(xiàng)：
1、注意無(wú)菌操作，一旦發(fā)現(xiàn)污染（孔）必須及時(shí)處理；
2、計(jì)數(shù)細(xì)胞要求準(zhǔn)確，稀釋量亦要準(zhǔn)確，否則將造成一孔多細(xì)胞克隆或克隆百分離太低；
3、在計(jì)數(shù)克隆出現(xiàn)率之前，不宜更換培養(yǎng)液，也不宜強(qiáng)烈振動(dòng)培養(yǎng)板；
4、做克隆化培養(yǎng)的小牛血清必須是優(yōu)質(zhì)血清；
5、若做克隆抗體檢測(cè)時(shí)，特別要保護(hù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，防止細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚**丟失。
七、說(shuō)明：
哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)分離、稀釋接種，培養(yǎng)在適宜于單細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中，形成細(xì)胞克隆。運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)可以制作細(xì)胞成活曲線，即在接種相同數(shù)量細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，加入不同濃度的化學(xué)藥品，或照以不同劑量的射線，觀察其對(duì)細(xì)胞的聽(tīng)見(jiàn)害程度。由此可以在哺乳類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)及分離突變細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn) 雜交瘤細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇技術(shù)

一、目的：
掌握凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的技術(shù)
雜交瘤細(xì)胞株一經(jīng)建立應(yīng)盡快凍存，以保證雜交瘤細(xì)胞不**于因傳代污染或因變異而丟失，在克隆化前將抗體陽(yáng)性的樣本凍存，在一旦克隆傳代失敗或在增殖過(guò)程中丟失，還可將保存的雜交瘤細(xì)胞重新復(fù)蘇，繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞凍存還可避免繁重的細(xì)胞傳代工作量以及不明原因的污染和細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的變異。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
用于細(xì)胞融合的骨髓細(xì)胞株也可同樣方法保存：以取得穩(wěn)定可靠的親本細(xì)胞來(lái)源。因此，冷凍保存細(xì)胞株是雜交瘤研究的一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
該技術(shù)同樣適用于一般動(dòng)物細(xì)胞的冷凍和保存。
二、原理：
主要是城保護(hù)下，降低保存溫度甚**用深低溫（—196）保存，借以減低或幾乎停止細(xì)胞的活力的能量產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，從而延長(zhǎng)保存期。
冷凍保護(hù)劑有許多種類(lèi)，而較普遍采用的是二甲基亞礬（Demathy,Sulfoxide,DMSO）它的作用既能降低細(xì)胞的新陳代謝，又能維護(hù)細(xì)胞膜的強(qiáng)度，使水分不易進(jìn)入細(xì)胞而影響其冷凍保存。
三、試劑、器材：
1640完全培養(yǎng)基，10%DMSO-1640完全培養(yǎng)基，無(wú)血清1640培養(yǎng)基。
恒溫水浴、液氮罐、玻璃安瓶或帶密封蓋的塑料小管，裝安瓶的小布袋，刻度離心管，膠塞、培養(yǎng)或小培養(yǎng)瓶、小燒杯、細(xì)胞計(jì)數(shù)用器材。
四、操作方法：
1、細(xì)胞懸液配制：取生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)良好的待凍存細(xì)胞，用離心法收集細(xì)胞，并用凍存培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)**3-5×10⁶/ml。
2、分裝：將細(xì)胞懸液注入2ml安瓶中或塑冷凍管中，每支0.5—1.0ml，封緊（安瓶用火焰封口），每只安瓶上標(biāo)上細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期、裝入小布袋中。
3、緩慢降溫，原則上要使凍存細(xì)胞瓶的溫度每分鐘下降1℃，待降**-60℃-70℃時(shí)，再將細(xì)胞浸沒(méi)有液氮中，各實(shí)驗(yàn)室的操作方法根據(jù)細(xì)胞的種類(lèi)和經(jīng)驗(yàn)略有不同，以下兩法均可使用。
①將細(xì)胞管先放置4℃或普通冰箱冰格內(nèi)2小時(shí)，再移**液氮容器面上，停留30分鐘后（約-60℃-70℃），再浸入液氮中。
②將細(xì)胞瓶放入壁厚1—2cm的聚乙烯泡沫塑料盒中（自制），密封后，放在—80℃冰箱中過(guò)夜，次日將細(xì)胞瓶移**液氮中。
亦有人將安瓶放在4℃冰箱中4小時(shí)，再置安瓶于氣態(tài)氮中20分鐘，然后立即放入液態(tài)氮中。
五、細(xì)胞復(fù)蘇：
1、從液氮罐中取出安瓶或其它類(lèi)型塑料冷凍管，有時(shí)冷凍管因未封嚴(yán)，浸入液氮后，取出后安瓶或管子內(nèi)液迅速氣化可以爆炸（力量有限）因此應(yīng)戴手套和防護(hù)眼鏡。
2、迅速放入裝有37℃-40℃的熱水燒杯中（放在超凈工作臺(tái)內(nèi)），用鑷子夾緊并不時(shí)搖動(dòng)，令盡快融化。
3、如用安瓶冷存，取出后，用70℃酒精擦試消毒后。折斷頸部，如用塑料管，則防止融融時(shí)滲入水，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出懸液，注入離心管中，再補(bǔ)加10毫升培養(yǎng)液（滴加）；或直接滴入裝有10ml培養(yǎng)液中（可以用無(wú)血清培養(yǎng)液）。
4、低速離心（1000轉(zhuǎn)/分）5-7分鐘，去上清，一般不再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。
5、用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶中或24孔培養(yǎng)板中37℃5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。
6、以后仍按常規(guī)傳代培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)：
1、安瓶或管內(nèi)凍存的細(xì)胞數(shù)量要充分，在融解后能允許做1：10-1：20的稀釋?zhuān)?*后細(xì)胞數(shù)量/毫升仍要比一般高一些，一般再培養(yǎng)接種濃度為5×10⁴/毫升，因此凍存細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到10⁷毫升，在融后稀釋20倍后，仍能保持5×10⁵/毫升數(shù)量。
2、加入一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞有助于復(fù)蘇細(xì)胞成活，飼養(yǎng)細(xì)胞的密度一般10⁵/毫升左右。
3、一般復(fù)蘇細(xì)胞的成活率在20—70%左右。
實(shí)驗(yàn)  百合鱗莖培養(yǎng)
    一、目的要求
    百合在生產(chǎn)上存在著三個(gè)亟待解決的問(wèn)題：一是用種量很大，每667m²百合按常規(guī)栽培，需用種250kg左右；二是繁殖系數(shù)低，每667m²只能收獲1 000kg左右；三是難以進(jìn)行有性繁殖。因而采用組織培養(yǎng)方法對(duì)百合進(jìn)行快速無(wú)性繁殖很有前途。本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)習(xí)和掌握百合鱗莖培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)。
    二、材料、儀器與試劑
    1．材料：百合。
    2．儀器：超凈工作臺(tái)(或無(wú)菌箱)、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、長(zhǎng)把鑷子、燒杯(500m1)、9cm培養(yǎng)皿、移液管等。
    3．試劑：①M(fèi)S培養(yǎng)基，并附加NAA(或2，4-D及IBA)0．5～1．0mg／L和BA(或KT)0．1～1．Omg／L；②75％酒精；③O．1％升汞。
    三、方法步驟
    1．外植體消毒。取健康的百合鱗片，先用洗滌劑清洗干凈，再用75％酒精消毒30s和0．1％升汞消毒30min左右，**好加一點(diǎn)吐溫以得到良好的消毒效果，再用無(wú)菌水沖洗3次。較大鱗片可切成小切塊以備接種。
    2．外植體的接種和培養(yǎng)。將消毒后的鱗片小切塊，在無(wú)菌條件下直接接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度一般為25℃±1℃，每天用日光燈照射lOh左右。光照度為1 000～1 5001x。
    3．培養(yǎng)基的選用。培養(yǎng)基一般以MS培養(yǎng)基為主，只要附加適當(dāng)?shù)闹参锷L(zhǎng)物質(zhì)即可。生長(zhǎng)素一般用NAA(或2，4-D及IBA)0．5～1．0mg／L。細(xì)胞分裂素一般用BA(或KT)0．1～1．0mg／L。為了促進(jìn)根系和增加鱗莖重量，可考慮光暗交替培養(yǎng)和適當(dāng)增加生長(zhǎng)素的濃度。
    4．試管苗的誘導(dǎo)。
    (1)由鱗片小切塊誘導(dǎo)成苗。鱗片小切塊接種后，一般先分化出黃綠色或綠色的球形突起的小芽點(diǎn)，繼而芽點(diǎn)逐漸增大長(zhǎng)成小鱗莖，并可生長(zhǎng)出葉片，形成苗叢，生根后即可以從試管(或三角瓶)中取出，移栽于營(yíng)養(yǎng)缽或大田。也可將小鱗莖繼代培養(yǎng)擴(kuò)大繁殖。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
    (2)由葉片誘導(dǎo)成苗。用鱗片小切塊誘導(dǎo)分化出的苗叢，在超凈臺(tái)上取其無(wú)菌葉片，接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)半個(gè)月后即可分化出帶根的小鱗莖。培養(yǎng)兩個(gè)月后，每個(gè)單葉片形成的小鱗莖一般又可分化出帶有根系的叢生小鱗莖4～6個(gè)。葉片培養(yǎng)可直接插入培養(yǎng)基中，但要注意極性，不可倒置。葉片也可平放于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
    (3)由無(wú)菌小鱗片誘導(dǎo)成苗。利用試管中的無(wú)菌小鱗莖，在超凈臺(tái)上將小鱗片逐片接種于培養(yǎng)基中(鱗片基部向下或內(nèi)側(cè)面向上)。培養(yǎng)半個(gè)月左右即可開(kāi)始分化，培養(yǎng)一個(gè)月左右即可分化出小鱗莖和根系，培養(yǎng)兩個(gè)月后，每個(gè)小鱗片一般又可分化出帶有根系的叢生小鱗莖4～6個(gè)。
    (4)由愈傷組織誘導(dǎo)成苗。上述外植體在分化成苗的過(guò)程中，常常也可伴隨著增殖具有顆粒狀似胚性細(xì)胞團(tuán)的愈傷組織。該愈傷組織在連續(xù)不斷的繼代培養(yǎng)中，一方面繼續(xù)不斷地增殖相似的愈傷組織，另一方面又不斷地分化成苗。一般每個(gè)試管里的愈傷組織可分化成苗20～40個(gè)。這樣即可周而復(fù)始地分化出大量的試管苗。
    四、實(shí)訓(xùn)報(bào)告
    寫(xiě)出該實(shí)訓(xùn)的報(bào)告。
實(shí)驗(yàn) 大蒜葉片培養(yǎng)
一、目的要求
    目前大蒜生產(chǎn)上存在的主要問(wèn)題是病毒造成的品種退化，使產(chǎn)量降低。為了克服病毒的侵染，采用莖尖培養(yǎng)進(jìn)行脫毒和快繁。本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)習(xí)和掌握大蒜葉片培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)，為大蒜莖尖培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。
    二、材料、儀器與試劑
    1．材料食用大蒜。
    2．儀器  超凈工作臺(tái)(或無(wú)菌箱)、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、長(zhǎng)把鑷子、燒杯(500m1)、9cm培養(yǎng)皿、移液管等。
    3．試劑  ①M(fèi)S_l培養(yǎng)基：MS+500mg／L水解乳蛋白、1 000mg／L酵母提取物、2mg／L 2，4-D；②MS₂培養(yǎng)基：MS+6-BA 2mg／L+NAA 0．01mg／L；③MsS₃培養(yǎng)基：MS+6-BA 2mg／L+IAA 0．05mg／L；④MS₄培養(yǎng)基：MS+KT0．5mg／L+6-BA 0．05mg／L十IAA 5mg／L+酵母提取物800mg／L。
    三、方法步驟
    1．以食用大蒜的未經(jīng)萌動(dòng)的肉質(zhì)、瓣?duì)钚△[莖為材料，在無(wú)菌條件下去掉保護(hù)葉，用刀片將貯藏葉切成長(zhǎng)、寬和深度各約為3mm的小塊。然后接種于MS_l培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織。
    2．培養(yǎng)3d后，就有少數(shù)外植體開(kāi)始膨大，10d有愈傷組織出現(xiàn)。其后，在愈傷組織表面產(chǎn)生大量光滑的小球體。
    3．將愈傷組織轉(zhuǎn)移到去掉2，4-D的分化培養(yǎng)基上，經(jīng)一個(gè)月左右可分化出苗，其中以MS₂及MsS₃培養(yǎng)基配方**好，苗的分化頻率可達(dá)80％以上。在生長(zhǎng)素較高的MS₄培養(yǎng)基上，一個(gè)月后，不僅有苗分化，而且還可分化出根。
    四、實(shí)訓(xùn)報(bào)告
    寫(xiě)出該實(shí)訓(xùn)的報(bào)告，并比較3種分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。
實(shí)驗(yàn)  蘋(píng)果胚培養(yǎng)
    一、目的要求
    掌握胚培養(yǎng)的基本過(guò)程，學(xué)會(huì)種子胚的剝離方法。
    二、材料與用具
    1．材料：①經(jīng)層積處理成熟飽滿(mǎn)的蘋(píng)果種子；②MS培養(yǎng)基。
    2．儀器：超凈工作臺(tái)，高壓蒸汽滅菌鍋，烘箱，光照培養(yǎng)箱或恒溫室，酸度計(jì)或pH試紙，電子天平，微量吸液管若干，雙筒解剖鏡，漏斗直徑6～8cm和12～14cm的各兩只，500ml和1 000ml試劑瓶若干只，培養(yǎng)皿(直徑6～9cm)若干，燒杯(50ml、100ml、500ml、1 000m1)各兩只，容量瓶或量筒(10ml、50ml、100ml、1 000m1)各2只，三角瓶(100m1)50～100只，酒精燈，玻璃框架2個(gè)，玻璃棒若干，棉花塞，牛皮紙，稱(chēng)量紙，鋁箔，線繩，牛皮筋，剪刀，解剖刀，鑷子，接種針，濾紙，研缽等。
    3．試劑：MS大量元素母液，MS微量元素母液，MS鐵鹽母液，MS有機(jī)物母液，各種植物生長(zhǎng)物質(zhì)貯備液，蔗糖，瓊脂，1mol NaOH溶液，1mol HCl溶液，次氯酸鈉溶液， 95％乙醇。
    三、方法步驟
    1．配制培養(yǎng)基。配制MS培養(yǎng)基1L，分裝**50只小三角瓶中，用棉花塞、牛皮紙封口，并包扎?；?qū)X箔裁成小片，封口。高壓蒸汽滅菌后備用。
  2．材料與消毒。將經(jīng)層積處理成熟飽滿(mǎn)的蘋(píng)果種子在蒸餾水中浸泡12h，用70％的乙醇浸泡消毒10s，然后用12％～14％的次氯酸鈉滅菌15min，經(jīng)無(wú)菌水沖洗3次后，鋪在經(jīng)高壓滅菌的1％瓊脂上。70d后剔除生根的種子，剩下的種子消毒后分離胚組織。
    3．器械消毒。先將玻璃棒在酒精燈火焰上滅菌。然后將解剖刀、解剖針和鑷子的先端放在95％的乙醇中蘸一下，再在酒精燈火焰上灼燒滅菌，逐一將它們放在玻璃棒上冷卻，待用。
    4．種胚剝離培養(yǎng)。將一粒種子放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用鑷子夾住，用解剖刀先將種皮劃破，再用另一把鑷子輕輕把種皮剝?nèi)ィ媒馄实堆嘏咛サ倪吘壭⌒膭冸x胚乳。分離出胚后，用無(wú)菌蒸餾水將每一個(gè)胚胎沖洗3次，然后移人裝有培養(yǎng)基的三角瓶中。將接有胚的三角瓶放人黑暗中培養(yǎng)，保持溫度25℃。培養(yǎng)3～4d后，轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。觀察其生長(zhǎng)狀況。
    5．試管苗移栽。待苗長(zhǎng)成后，將苗從培養(yǎng)瓶中小心夾出，洗去培養(yǎng)基，移入營(yíng)養(yǎng)缽中，栽于經(jīng)過(guò)干熱滅菌處理的蛭石內(nèi)，溫度保持在25℃。蓋上塑料薄膜保溫、保濕，移入日光溫室進(jìn)行馴化。一周后打開(kāi)一個(gè)3～5mm的小縫，以后每天加寬通風(fēng)縫，直**揭去塑料薄膜。當(dāng)長(zhǎng)出新葉時(shí)，即可移人大田。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
    四、實(shí)訓(xùn)報(bào)告
觀察胚的生長(zhǎng)變化，做詳細(xì)記錄。
實(shí)驗(yàn) 胡蘿卜離體根培養(yǎng)
    一、目的要求
胡蘿卜是細(xì)胞和組織培養(yǎng)中的經(jīng)典材料，來(lái)源方便。是教學(xué)實(shí)驗(yàn)的良好材料。本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)習(xí)胡蘿卜離體根培養(yǎng)的基本方法和步驟，學(xué)會(huì)和掌握誘導(dǎo)愈傷組織的基本技術(shù)。
二、材料、儀器與試劑
    1．材料  市售大而新鮮的胡蘿卜。
    2．儀器  超凈工作臺(tái)(或無(wú)菌箱)、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、刮皮刀(蔬菜用具)、不銹鋼打孔器、長(zhǎng)把鑷子、燒杯(500m1)、9cm培養(yǎng)皿、移液管等。
    3．試劑①M(fèi)S培養(yǎng)基(配法見(jiàn)有關(guān)章)，并附加10mg／L 2，4-D和2mg／L -BA；②70％乙醇，飽和漂白粉溶液；00．05％甲苯胺藍(lán)(Toluidine blue 0)。
    三、方法步驟
    1．將胡蘿卜用自來(lái)水沖洗干凈，用刮皮刀除去表皮1--2mm，橫切成大約10mm厚的切片。以下步驟全部在無(wú)菌條件下操作。
    2．胡蘿卜片經(jīng)70％乙醇處理幾秒鐘后，無(wú)菌水沖洗一遍，再用飽和漂白粉溶液浸泡10min，無(wú)菌水沖洗3～4次。
    3．將胡蘿卜片平放于培養(yǎng)皿中，一手用鑷子固定胡蘿卜片，一手用打孔器按平行于組織片垂直軸方向打孔。每個(gè)小孔應(yīng)打在靠近維管形成層的區(qū)域，務(wù)必打穿組織。然后從組織片中抽出打孔器，用玻棒輕輕將圓柱體從打孔器中推出，收集在裝有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中。重復(fù)打孔步驟，直**制備足夠數(shù)量的組織圓柱體。
    4．用鑷子取出圓柱體，放入培養(yǎng)皿中，用刀片切除圓柱體兩端各2mm長(zhǎng)的組織。將剩下的組織切成3個(gè)各約2mm厚的小圓片(此時(shí)，小圓片直徑5mm，厚2mm)，將制備好的小圓片轉(zhuǎn)移到裝有無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中。在整個(gè)切割操作中要多次火焰消毒鑷子和解剖刀，冷卻后再使用。
    5．用鑷子將圓片轉(zhuǎn)到滅菌的濾紙上(每次一片)，將圓片兩面的水分吸干，并立即植到培養(yǎng)基表面。注意接種時(shí)使三角瓶成一定的傾斜度，用手拿鑷子的接種過(guò)程不要直接在培養(yǎng)基上方完成，以減少污染機(jī)會(huì)。
    6．將培養(yǎng)物置于25℃溫箱中培養(yǎng)。也可將一部分放到光下培養(yǎng)，以比較光下和暗處對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的反應(yīng)。
    四、實(shí)訓(xùn)報(bào)告
    1．結(jié)果及觀察培養(yǎng)幾天后，外植體表面開(kāi)始變得粗糙，有許多光亮點(diǎn)出現(xiàn)，這是愈傷組織開(kāi)始形成的癥狀。經(jīng)數(shù)周培養(yǎng)后，將長(zhǎng)大的愈傷組織切成小塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。用放大鏡觀察愈傷組織表面特征。用解剖針挑取一些細(xì)胞置于玻片上，加一滴水，壓上蓋片，在顯微鏡下觀察愈傷組織細(xì)胞的特征。也可經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后再行觀察。
    2．作業(yè)  寫(xiě)出實(shí)訓(xùn)報(bào)告。