器材 ：
液氮冷凍灌、 恒溫培養(yǎng)箱、 電冰箱、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、 離心機、 分析天平、倒置顯微鏡、 超凈工作臺、彎頭吸管（1個）、膠頭滴管（9個）、  離心管（9個）、 帶塞培養(yǎng)瓶（不定個）、 試管架、 量桶、 燒杯、酒精燈、 抽濾瓶、G6型號細菌過濾漏斗、帶塞小玻璃瓶，大三角瓶 、無菌凍存管、液氮瓶。
試劑 ：
RPMI l640培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液， 小牛血清（生長因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇（消毒）,凍存培養(yǎng)液（培養(yǎng)液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS緩沖液或hanks液等。
器皿的消毒及準備：
1、玻璃器皿的清洗滅菌（5％鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml）：
（1）浸泡:新使用或重復使用的玻璃器皿須經5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質，并消除其弱堿性。
（2）刷洗:浸泡后用軟毛刷和優(yōu)質的洗潔精進行刷洗。刷洗后經行烘干。
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。清潔液具有極強酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。
（4）沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次，將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干凈透明，無油煙，不能殘留任何有害物質及化學藥品等。
（5）包裝滅菌:器材經清洗烤干或晾干后，先應嚴格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。
2、橡膠制品清洗消毒：
0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用
3、塑料制品的清洗消毒（瓶蓋、離心管）：
使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。
實驗前準備工作:
操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用酒精消毒。用紫外線消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進無菌室前或做完實驗后，均應開燈照射30min進行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。
細胞復蘇：
凍存細胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必須快速冷凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，致使細胞死亡。在凍存細胞的保存管中含有對細胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應馬上將其去除。在冷凍活化前應在無菌臺上將細胞培養(yǎng)液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37℃的溫水中快速使細胞解凍。解凍后懸液快速移入培養(yǎng)液中混勻，離心去掉上清液，再加入細胞培養(yǎng)液。
實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭實驗臺
（1）取一15ml離心管用滴管在其內滴加5--9ml培養(yǎng)液（取8ml）。                                                                                            
（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液轉移入上述離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來）。
（4）低速離心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培養(yǎng)液再清洗離心一次。
（5）離心后倒掉上清液，在離心管中滴加3ml培養(yǎng)液（RPMI-1640），混勻（可用滴管輕柔吹打）。
（6）將離心管中的混合液轉移到培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)瓶中滴加15滴10%小牛血清，蓋上瓶蓋，標好細胞種類和日期、培養(yǎng)人姓名等，將培養(yǎng)瓶平放，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換一次培養(yǎng)基。
細胞傳代：
當觀察到培養(yǎng)瓶中細胞鋪滿度為90%時（細胞生長處于對數(shù)期時），解凍復活成功后的細胞要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞細胞株的**大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。
（1）試驗臺的消毒工作準備好，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS液（不含鈣，鎂離子）洗1-2次，以免剩余培養(yǎng)液影響胰蛋白酶活性。（細胞貼壁生長）。
（2）向瓶內加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化（將培養(yǎng)瓶翻轉過來，以保證細胞沒有脫壁）。#p#分頁標題#e#
備注：若細胞沒有脫壁，生長良好，則直接倒掉消化液，加培養(yǎng)液8ml，離心收集細胞；若發(fā)現(xiàn)很多細胞已解離已脫壁（即解離過度），則直接加培養(yǎng)液進行離心收集細胞。
（4）倒出消化液，向瓶內用滴管加入培養(yǎng)液少量（約2ml），輕輕轉動培養(yǎng)瓶，把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再加3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清。
（5）使用吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
（6）將準備好的細胞懸液轉入離心管中，離心(1000r／min) 5min。
（7）將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養(yǎng)液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。
（8）取3個無菌培養(yǎng)瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過火消毒。
（9）在培養(yǎng)瓶中各加入1ml細胞懸液、2ml培養(yǎng)液（用移液槍）、15滴小牛血清，加好后酒精燈下過火加塞。
（10）細胞培養(yǎng)換液時間應根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。
細胞凍存：
細胞的凍存**常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護劑緩慢的冷凍細胞。由于細胞在不加任何保護劑的情況下，細胞內外水分會很快結成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度升高，PH值改變，部分蛋白質因此變性使細胞內部結構紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細胞內部結構破壞。因此在細胞凍存時的關鍵是盡可能減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成，故凍存時采用甘油或DMSO做保護劑，這兩種物質分子量較小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，對細胞毒害作用小，梯度慢速冷凍可使細胞內水分滲出細胞外，減少形成冰晶對細胞產生的傷害。細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
（1）選對數(shù)增生期細胞(細胞鋪滿度為90%左右時)，在凍存前1d換液。
（2）試驗臺的消毒工作準備好，倒掉培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。
（3）向瓶內加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。
（4）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清，終止消化。
（6）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞，按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液。
（7）將培養(yǎng)瓶中的細胞懸液轉移到15ml離心管中，(1200r／min) 6min，去掉上清液。再加3ml培養(yǎng)液按常規(guī)方法形成細胞懸液。
（8）配制凍存培養(yǎng)液（培養(yǎng)液7ml，10%小牛血清2ml，10%DMSO 1ml），于離心管中加入1ml細胞懸液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻。
（9）將細胞懸液分裝入無菌凍存管中，每管1.5 ml（凍存液要先預冷到4℃ ）；在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。
（10）凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增**-5℃～-10℃/ min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入液氮氣中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。（操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷）。