1，原代細(xì)胞培養(yǎng)
原代培養(yǎng)需要嚴(yán)格要求：（1）取材時(shí)需要去除脂肪和壞死的組織(2)為減少對(duì)組織的損傷，需用鋒利的器具(3)適度離心以去除用于解離的酶（4）由于原代培養(yǎng)組織細(xì)胞的存活率很低，故用于原代培養(yǎng)的細(xì)胞的密度應(yīng)高于正常的傳代培養(yǎng)的細(xì)胞密度。（5）營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基比單一的培養(yǎng)基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛馬的血清更好。(6)對(duì)于取材部位易于感染（如皮膚）應(yīng)先用70%乙醇消毒，在無(wú)菌條件下切除組織，盡快轉(zhuǎn)移入BSS或培養(yǎng)基中。不要再培養(yǎng)室取材，因?yàn)閯?dòng)物可引入微生物污染。若必須推遲，可保存在4℃，72h。
1.
剪切組織
先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術(shù)鑷去除粘附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后，用手術(shù)剪將組織剪成若干小塊，移入青霉素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復(fù)剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm
3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次。
2.
消化分離
消化分離的目的是將細(xì)小的組織塊消化分離成細(xì)胞團(tuán)或分散的單個(gè)細(xì)胞，以利于進(jìn)一步的培養(yǎng)，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。
3.
培養(yǎng)
細(xì)胞懸液用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2～5×10
5 cells／m1，或?qū)嶒?yàn)所需密度。分裝于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO
2培養(yǎng)箱內(nèi)，5％CO
2，37℃靜置培養(yǎng)。一般3～5d，原代培養(yǎng)細(xì)胞可以粘附于瓶壁，并伸展開始生長(zhǎng)，可補(bǔ)加原培養(yǎng)液量1／2的新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后換液，一般7～14 d可以長(zhǎng)滿瓶壁，進(jìn)行傳代。
注意事項(xiàng)：
1. 無(wú)菌操作 細(xì)菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見原因，必須加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的無(wú)菌操作觀念，以預(yù)防為主，一旦污染，一般是很難消除。
2. 培養(yǎng)液所用的培養(yǎng)液必須滿足細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的必要條件。由于細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物種類、組織類型不同，對(duì)培養(yǎng)液的要求有一定的差異，必要時(shí)可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。
3. 小牛血清 小牛血清對(duì)于維持培養(yǎng)細(xì)胞的生存和促進(jìn)細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵性作用?？蛇x擇多種不同批號(hào)的小牛血清進(jìn)行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號(hào)小牛血清后，就保持應(yīng)用**實(shí)驗(yàn)完成。
4. 膠原酶溶液 必須新鮮配制，貯存時(shí)間過長(zhǎng)(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導(dǎo)致消化時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞損傷增加。
5. L—谷氨酰胺 幾乎所有細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺都有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞會(huì)因生長(zhǎng)不良而死亡。谷氨酸胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時(shí)，就應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。
6. 靜置培養(yǎng) 原代細(xì)胞在消化分離后，置于CO
2培養(yǎng)箱的頭24-48h (必要時(shí)72 h)內(nèi)，應(yīng)處于**靜置狀態(tài)，切忌不時(shí)地取出培養(yǎng)瓶觀察生長(zhǎng)狀況，這將使原代分離細(xì)胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖。這對(duì)初學(xué)者尤應(yīng)注意。不必?fù)?dān)心培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成份會(huì)消耗光，在細(xì)胞增殖之前對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細(xì)胞貼壁伸展。
7. 消化時(shí)間 一般消化**肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因?yàn)榇藭r(shí)組織顆粒已經(jīng)松散，略經(jīng)吹打即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，過久的消化往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞培養(yǎng)成活率降低。
8. 其它生長(zhǎng)因子經(jīng)過以上處理，一般原代分離細(xì)胞培養(yǎng)均可以成功。對(duì)于少數(shù)特殊類型細(xì)胞也可以考慮加一些特殊的生長(zhǎng)因子。如胰島素能促使細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外,內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費(fèi)用較高。
原代外植（組織塊培養(yǎng)）
簡(jiǎn)介：組織切碎并清洗，組織塊接種于培養(yǎng)瓶或皮氏培養(yǎng)皿的表面，加入少量含高濃度血清（40%-50%）的培養(yǎng)基，表面張力使標(biāo)本保持原位，直到他們自發(fā)地貼附于表面，隨后細(xì)胞開始生長(zhǎng)。此方法適合小量組織培養(yǎng)，如皮膚活檢組織，為了盡可能減少細(xì)胞損失，而不用酶或機(jī)械方法。
操作流程：切割→細(xì)切→沉淀清洗→清洗后用吸管轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶→傾斜培養(yǎng)瓶吸出平衡鹽溶液→然后加入一薄層培養(yǎng)基→培養(yǎng)2-3w,
無(wú)菌材料：培養(yǎng)基（DMEM與F12等體積混合，再加20%胎牛血清）；100ml的DBSS;9cm皮氏平皿，非組織培養(yǎng)級(jí)別；尖頭鑷子，尖頭手術(shù)刀；100ml廣口移液器；15或20ml離心管；25平方厘米的培養(yǎng)瓶或5厘米的皮氏培養(yǎng)皿，大約100mg組織用5個(gè)25平方厘米的培養(yǎng)瓶。開始每瓶放1ml培養(yǎng)基，隨后3-5天每瓶加**5ml.
操作步驟：
1，將組織移入新鮮無(wú)菌BSS浸洗
2，移入第2個(gè)培養(yǎng)皿切除多余組織，如脂肪或壞死組織，用手術(shù)刀交叉切成約1mm
3的小塊。
3，用移液管（先用BSS浸潤(rùn)，否則組織塊易貼壁）將組織塊移入15或50ml離心管或普通容器中，讓組織塊靜置沉淀。
4，用BSS重懸沖洗組織塊后靜置，去除上清液，重復(fù)兩次或更多#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5，將20-30個(gè)組織塊接種在25平方厘米的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（記住濕潤(rùn)移液管）
6，將培養(yǎng)瓶靜置放置一會(huì)，待組織塊沉下去，然后稍微傾斜吸出液體，然后以每25平方厘米生長(zhǎng)面加入1ml的培養(yǎng)基，緩緩傾斜培養(yǎng)瓶讓組織塊均勻分布于生長(zhǎng)面上。
7，蓋上瓶蓋，放到37℃培養(yǎng)箱中18-24h.
8, 如果組織塊已經(jīng)貼附，則可在未來(lái)3-5天內(nèi)將培養(yǎng)基加**5ml.先預(yù)溫，以后每周更換一次，直到細(xì)胞已生長(zhǎng)
9，外植塊可以自生長(zhǎng)中心用鑷子取出，用預(yù)先浸洗的移液管移入新的培養(yǎng)器皿中，，然后蓋上蓋子，再繼續(xù)培養(yǎng)。
10.更換**瓶的培養(yǎng)基直**細(xì)胞生長(zhǎng)超過生長(zhǎng)面積的一半，此時(shí)細(xì)胞可以傳代。
總結(jié)：此種方法貼壁率很低，但是可用通過一些方法進(jìn)行改進(jìn)。如在外植物的上方放一塊蓋玻片，或?qū)⑼庵参镏糜谏w玻片的邊緣，
2酶的解離消化
組織中細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附是依靠多種相互作用的同類糖蛋白分子，其中部分粘附分子具有鈣離子依賴性（鈣粘素），故對(duì)EDTA較為敏感，螯合素含有鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合到細(xì)胞外機(jī)制中的RDG序列。細(xì)胞間基質(zhì)和基底膜中含有其他糖蛋白對(duì)蛋白酶較為敏感；選擇消化液**容易的方法是從單一的消化液入手，過渡**復(fù)合的消化液，開始用胰蛋白酶或胰蛋白酶/EDTA的混合物，后加入其他蛋白酶促進(jìn)消化。由于新生和成年動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)開始分化，纖維結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)增多，未分化的增殖細(xì)胞減少。對(duì)組織進(jìn)行分離時(shí)，損害愈嚴(yán)重（長(zhǎng)時(shí)間的胰酶消化，攪拌），組織越易被破壞成碎片，為了保持**大活性，無(wú)論酶的純度如何，應(yīng)該**大限度的減少胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用時(shí)間。當(dāng)整塊組織在37℃的胰酶中消化時(shí)，已分離的細(xì)胞應(yīng)每隔半小時(shí)收集一次，胰蛋白酶經(jīng)離心去除，再以含血清的培養(yǎng)基中和。即可以應(yīng)用冷消化或溫胰酶消化。
2.1胰酶的溫消化
此技術(shù)適應(yīng)于在相當(dāng)短的時(shí)間消化大的組織尤其是整個(gè)小鼠胚胎或雞胚。由于成年組織有大量纖維結(jié)締組織，故成年組織不用此法。較敏感的細(xì)胞如上皮細(xì)胞也不用此法。
無(wú)菌材料：組織1-5g,DBSS50ml,用PBSA或正常生理鹽水配制的2.5%粗制胰酶；PBSA 200ml,含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（DMEM/F12加10%胎牛血清）；培養(yǎng)瓶，每克組織5-10個(gè)(根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞不同而改變）；9cm皮氏平皿，非組織培養(yǎng)級(jí)別；兩個(gè)50ml離心管；250ml錐形瓶；磁力攪拌子在試管中高壓消毒；彎頭鑷子，2ml,10ml移液管。
非滅菌材料：
磁力攪拌器，細(xì)胞計(jì)數(shù)板
操作步驟：
1，將組織塊移入加有新配制的無(wú)菌DBSS皮氏培養(yǎng)皿中，清洗
2，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿，切除多余組織如脂肪或壞死組織，用刀切成約3mm
3小塊
3，用彎頭鑷將組織移入15ml或50ml無(wú)菌離心管或容器中，讓組織塊沉淀
4，用DBSS清洗組織塊，組織塊沉淀，去除上清液，如此反復(fù)2次以上。
5，將組織塊轉(zhuǎn)入一個(gè)空的錐形瓶中，去除多余液體，然后加入180ml的PBSA，
6，加入2.5%的胰酶20ml。以使胰酶**終濃度為0.25%
7, 在錐形瓶中加入攪拌子
8，封住錐形瓶，放到攪拌器上，在37攝氏度溫箱內(nèi)攪拌
9，每分鐘100r, 30min
10,,30min后，收集解離的細(xì)胞: 讓組織塊沉淀； 吸出上清液，置入離心管中，放在冰上，向錐形瓶中加入新的胰酶溶液消化剩余的組織塊，繼續(xù)攪拌并孵育 30min; 收集的細(xì)胞懸液以500g,5min離心; 用10ml含血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞團(tuán)，儲(chǔ)存于冰浴中。
11，重復(fù)第10步的過程直**消化完全為止（大約3-4h)
12, 收集冷的細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞技術(shù)，并檢測(cè)細(xì)胞活性
13，將細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基稀釋，使每毫升培養(yǎng)基含有1 x 10
6個(gè)細(xì)胞。接種到培養(yǎng)瓶中，大約每平方厘米為2 x 10
5個(gè)細(xì)胞。但是對(duì)于存活率不明確或難以預(yù)知時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)價(jià)值。此時(shí)建議每毫升5-25mg組織的濃度接種。
14，每隔2-4天更換一次培養(yǎng)基（以PH下降為標(biāo)準(zhǔn)）。由于部分細(xì)胞粘附較慢甚**易于懸浮生長(zhǎng)，所以更換上清液前要先檢查上清液中存活的細(xì)胞。
總結(jié);此方法應(yīng)該把握時(shí)間，減少對(duì)細(xì)胞的損傷?？梢酝ㄟ^如下簡(jiǎn)單方法來(lái)減少細(xì)胞的損害：在4℃將組織浸入胰酶，胰酶此時(shí)活性很小的條件下浸透組織，然后放在37℃， 在很短時(shí)間即可將組織消化。
2.2胰酶的冷消化
無(wú)菌材料：培養(yǎng)基（DMEM/F12，含10%胎牛血清）；DBSS; 0.25%粗制胰酶溶于無(wú)血清的RPMI1640或MEM/Stirrer salts(S-MEM)中；9cm皮氏平皿，非組織培養(yǎng)級(jí)別；直頭，彎頭鑷子；剪刀；25ml螺口錐形瓶；25cm
2、75cm
2培養(yǎng)瓶；2ml,10ml移液器
非滅菌材料：冰浴
操作步驟：
1，將組織移入加有新配制的無(wú)菌DBSS的皮氏培養(yǎng)皿中，清洗。
2，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中，切除多余組織如脂肪和壞死組織，用手術(shù)刀細(xì)切成大約3mm#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
3的小塊，對(duì)于胚胎器官若小于3mm
3可以全部保留
3，用彎鑷子將組織塊移入15ml或50ml無(wú)菌離心管或普通容器中，讓組織塊沉淀
4，用BSS重懸沖洗組織塊，沉淀后去除上清，重復(fù)此步驟2次以上
5，去除剩余液體，每克組織加入10ml溶于RPMI1640的0.25%胰酶，置于4℃。
6，在4℃放置6-18h,
7,小心去除胰酶，余下組織及殘余胰酶（若需要此時(shí)可以加入1-2ml其他酶）
8,37℃，放置20-30min
9,加入溫培養(yǎng)基，大約每100mg初始組織加1ml，輕輕吹打混合物**組織完全分散開。
10，若部分組織未分散，細(xì)胞懸液可以用無(wú)菌的平紋紗布或不銹鋼（100-200微米）或falcon 70mm細(xì)胞濾器進(jìn)行過濾細(xì)胞。如果有較多的組織時(shí)，可在每克組織多加入20ml培養(yǎng)基促進(jìn)沉淀和隨后的懸液收集，通常2-3min就足以去除大多數(shù)的大塊組織。
11，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量并定量細(xì)胞密度
12，將細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基稀釋，使每毫升培養(yǎng)基含有1 x 10
6個(gè)細(xì)胞，接種培養(yǎng)瓶中同上要求。
13，隔2-4天更換一次培養(yǎng)基（以ph下降為標(biāo)準(zhǔn)）。由于部分細(xì)胞粘附較慢甚**易于懸浮生長(zhǎng)，所以更換上清液前要先檢測(cè)上清液中的存活細(xì)胞。
總結(jié)：與溫消化相比，冷消化可以獲得較高的細(xì)胞存活率，24h生存率。可保留更多的細(xì)胞種類。但是不適合大塊組織（大于10g),可以用于小鼠胚胎的上皮細(xì)胞，胚鼠的肝臟血細(xì)胞培養(yǎng)。
2.3 細(xì)胞傳代時(shí)，細(xì)胞與培養(yǎng)皿的分離
（1）傳代時(shí)應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞活力，活力好的細(xì)胞應(yīng)該密度小，活力差的細(xì)胞應(yīng)該密度高些。
（2）吸出過多的細(xì)胞培養(yǎng)基，用不含有鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液或EDTA溶液沖洗細(xì)胞。從培養(yǎng)瓶中與細(xì)胞生長(zhǎng)面相對(duì)的一側(cè)加入沖洗液，搖晃培養(yǎng)瓶1-2分鐘，沖洗細(xì)胞層倒掉沖洗液
（3）按照2-3ml/25cm
2的用量，從培養(yǎng)瓶中與細(xì)胞生長(zhǎng)面相對(duì)的一側(cè)加入所選的解離液，確保解離液可覆蓋細(xì)胞層，將培養(yǎng)瓶置入37℃條件下培養(yǎng)，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，通常細(xì)胞會(huì)在5-15分鐘內(nèi)解離。不同細(xì)胞系解離所需的時(shí)間可能有所差異。對(duì)于難以從基質(zhì)上分離的細(xì)胞系，可通過拍打培養(yǎng)瓶的方式加速細(xì)胞分離。
（4）細(xì)胞完全分離后，將培養(yǎng)瓶呈直立位放置，使細(xì)胞流**培養(yǎng)瓶底部，向培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打單層細(xì)胞表面，使細(xì)胞分散。計(jì)數(shù)細(xì)胞并傳代。
要求：對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系或強(qiáng)貼壁性細(xì)胞系，用不含鈣離子和鎂離子的PBS進(jìn)行沖洗，解離液用0.25%的胰蛋白酶或胰酶+EDTA，以不含有鈣鎂離子的平衡鹽溶液進(jìn)行配制.
2.4原代組織中的細(xì)胞解離
（1）shou先無(wú)菌采集組織，切除不需要的組織，用無(wú)菌手術(shù)刀或者剪刀將余下的組織切成2-4mm大小的碎塊。用不含有鈣鎂離子的平衡鹽溶液重新懸浮組織碎塊，進(jìn)行清洗。待組織塊沉淀后，吸出上清液。反復(fù)沖洗2**3次。
（2）將裝有組織塊的容器置于冰上，吸出所有的上清液，加入含有0.25%胰酶，不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液（100mg組織加入大約1ml胰蛋白酶溶液。
（3）在4℃下孵育**6-18小時(shí)，以便通過**小的胰蛋白酶活性獲得**大的穿透效果。
（4）小心倒掉過量的胰蛋白酶溶液，將組織塊與殘留的胰蛋白酶溶液在37℃條件下共同孵育20-30分鐘。
（5）向組織塊中加入加熱的完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，使組織分散。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，則還需要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
（6）用滅菌的紗布或者無(wú)菌不銹鋼紗網(wǎng)（100-200μm）過濾細(xì)胞懸液，使殘余的組織完全分散，計(jì)數(shù)并接種細(xì)胞。
3細(xì)胞傳代培養(yǎng)
傳代
當(dāng)細(xì)胞密度（每平方厘米基質(zhì)的細(xì)胞數(shù)）達(dá)到鋪滿整個(gè)瓶底的有效基質(zhì)時(shí)，或者當(dāng)細(xì)胞濃度（每毫升培養(yǎng)基的細(xì)胞數(shù)）超出培養(yǎng)基的能力時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)停止或生長(zhǎng)速度大大放緩。這時(shí)就需要更頻繁地更換培養(yǎng)基或者進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
傳代標(biāo)準(zhǔn)：用于判定單層細(xì)胞是否需要傳代
（1）細(xì)胞密度：正常細(xì)胞長(zhǎng)**彼此匯合時(shí)需要傳代。轉(zhuǎn)化細(xì)胞同樣如此
（2）培養(yǎng)基耗盡：一般ph降低伴隨著細(xì)胞密度的增加，這是需要傳代的主要指標(biāo)。
（3）距上次傳代的時(shí)間：常規(guī)穿戴**好依照嚴(yán)格的時(shí)間進(jìn)行。若到了該傳代的時(shí)間細(xì)胞還沒有達(dá)到足夠高的密度（即細(xì)胞沒有彼此匯合），則應(yīng)增加接種密度；相反，如果細(xì)胞很快彼此匯合，則要降低接種密度。從而使在一定的接種密度下細(xì)胞的周期性生長(zhǎng)將與培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞產(chǎn)量相一致。理性的細(xì)胞濃度是使細(xì)胞每3-4天更換培養(yǎng)基，每7天傳代。
傳代所需無(wú)菌材料：
完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基；以PBS配制的終濃度為0.25%胰酶；培養(yǎng)瓶。
非滅菌材料：
血細(xì)胞計(jì)數(shù)板或電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
傳代前準(zhǔn)備：
1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
2.用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。將試劑及材料置于超凈臺(tái)上，.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
3.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。
4.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。
5.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。
6.需要傳代按以下操作
從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，仔細(xì)檢查培養(yǎng)物有無(wú)污染或衰退跡象，根據(jù)傳代標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行觀察并決定是否需要傳代，
7.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒，棄去舊培養(yǎng)基，為了避免沖散細(xì)胞，沿培養(yǎng)瓶細(xì)胞對(duì)側(cè)加入PBS（0.2ml/cm
2），清洗細(xì)胞，去除清洗液，以去除殘留血清。
加胰酶（0.1ml/cm
2）到培養(yǎng)瓶細(xì)胞面對(duì)側(cè)，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶平放以確保胰酶完全覆蓋細(xì)胞層，靜置15-30s,棄去大部分胰酶，只保留少量胰酶，主要不要使單層細(xì)胞脫落。使用4℃的胰酶可以防止細(xì)胞的成片脫落。
8，平直培養(yǎng)瓶孵育，直**細(xì)胞變圓隆起，豎直培養(yǎng)瓶，單層細(xì)胞就會(huì)從培養(yǎng)瓶表面滑落（通常發(fā)生在5-15min之后），注意不要消化過長(zhǎng)時(shí)間，另一方面也不要在細(xì)胞消化好前強(qiáng)制將細(xì)胞吹打下來(lái)，這樣將導(dǎo)致細(xì)胞的成片脫落。
9，加入培養(yǎng)液（0.1-0.2ml/cm
2），用吸管反復(fù)吹打單層培養(yǎng)細(xì)胞面以分散細(xì)胞，**后將吸管的**放于培養(yǎng)瓶底角，上下吹打細(xì)胞幾次，注意不要產(chǎn)生氣泡。充分上下吹打以分散細(xì)胞使之處于單細(xì)胞懸浮狀態(tài)。吹打的強(qiáng)度對(duì)于各個(gè)細(xì)胞系有所不同，有的細(xì)胞系很容易吹散，而有的則需要大力吹打才能分散。但若吹打力量過大，幾 乎所有的細(xì)胞都會(huì)受到剪切力的機(jī)械損傷。原代或早期幾代培養(yǎng)的細(xì)胞由于他們較脆弱和體積較大而尤其容易受到損傷，對(duì)于連續(xù)細(xì)胞系具有較大彈性，需要大力吹打才能完全解離。
10，制備單細(xì)胞懸液有助于計(jì)算細(xì)胞增值率或貼瓶率或進(jìn)行細(xì)胞克隆分離。
11，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
12，稀釋懸液到合適的接種濃度。方法一：加入適量細(xì)胞懸液到含有已知體積培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，此方法適合常規(guī)傳代，傳代瓶數(shù)不多且不需要準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)。方法二，稀釋細(xì)胞**所需的總體積，然后分裝到各個(gè)培養(yǎng)瓶中。此方法適用于同時(shí)做多個(gè)相同的培養(yǎng)，因?yàn)椴僮鞯拇螖?shù)減少，而且每一培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度完全一致。
13，用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。蓋上培養(yǎng)瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放回孵育箱中，大約1小時(shí)后檢查ph的變化，如果培養(yǎng)基在空氣相中ph升高，則要將培養(yǎng)瓶移**無(wú)菌區(qū)域內(nèi)，向其中快速（1-2s)吹入5%CO2，如果在5%CO2培養(yǎng)條件下ph還是很高，則可以增加CO2濃度到7%嘗試。但是此方法不可常用，如果問題長(zhǎng)存在可以在配置培養(yǎng)基時(shí)降低其ph，同時(shí)在培養(yǎng)箱中檢查培養(yǎng)基的ph.
注意事項(xiàng)：
1，在任何情況下，主要的細(xì)胞分離劑，不論是胰酶還是EDTA，僅做短暫停留，棄去大部分消化液后，僅留少量消化液進(jìn)行孵育。如果在分離細(xì)胞及以后的制備單細(xì)胞懸液過程中遇到困難，可采用替代步驟如下。
（1）對(duì)于有絲分裂期細(xì)胞及其他粘附較松的細(xì)胞，可以通過輕微機(jī)械振蕩，搖晃，或大力吹打，進(jìn)行細(xì)胞解離
（2）對(duì)于不可用蛋白酶的細(xì)胞系如受體或細(xì)胞表面蛋白分析，以及可造成一些細(xì)胞傷害，很難形成單細(xì)胞懸液的條件下，利用細(xì)胞刮刀進(jìn)行刮擦。
（3）多數(shù)的連續(xù)細(xì)胞系，在用0.01-0.5%粗胰酶，并經(jīng)完全去除培養(yǎng)基預(yù)處理?xiàng)l件下，可以只用胰酶即可將細(xì)胞分離。
（4）某些粘附性強(qiáng)的連續(xù)細(xì)胞系和很多早期細(xì)胞，用0.25%粗胰酶，及PBSA作為培養(yǎng)基預(yù)處理后，可以通過清洗+胰酶方法將細(xì)胞解離。
2，當(dāng)把塑料培養(yǎng)瓶放入到培養(yǎng)箱中會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)瓶?jī)?nèi)空氣的膨脹使得較大的培養(yǎng)瓶膨脹而不能放平?？梢詫⑴囵B(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中30min后快速擰松瓶蓋以減輕壓力，或者可以在蓋緊培養(yǎng)瓶前通過擠壓培養(yǎng)瓶的頂部或底部來(lái)解決這問題。
傳代時(shí)的細(xì)胞濃度
**好的確定方法是以不同的接種濃度接種后作生長(zhǎng)曲線，依此選擇出延遲期短，能很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（倍增時(shí)間短），并且下次傳代時(shí)可以方便地到達(dá) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期**高點(diǎn)的**小接種濃度。對(duì)于新的培養(yǎng)物，可以先以高濃度接種，再逐漸降低接種濃度直**獲得合適的生長(zhǎng)周期
而培養(yǎng)物又無(wú)衰退表現(xiàn)。
1．吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
2．向瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)
瓶底為宜。
3．置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化,2～5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。
4．吸出消化液，向瓶?jī)?nèi)加入Hanks液少量，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液,終止消化。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5．使用彎頭吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以防用力過猛損傷細(xì)胞。
6．用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO
2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
7．細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來(lái)確定。一般2～3天后應(yīng)換一次生長(zhǎng)液。待細(xì)胞鋪滿瓶皿底面，即可使用。也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。
注意事項(xiàng)：
1. 掌握好細(xì)胞消化的時(shí)間，消化時(shí)間過短時(shí)，細(xì)胞不宜從瓶壁脫落，過長(zhǎng)的消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷。
2. 掌握好消化濃度，當(dāng)消化液濃度過高時(shí)，消化時(shí)間應(yīng)縮短，過低時(shí)細(xì)胞消化時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)。
4細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇
細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存（凍存液要現(xiàn)配）。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲(chǔ)存時(shí)間幾乎是無(wú)限的，若細(xì)胞凍存在-152℃，保存期為一年，一年內(nèi)需復(fù)蘇重新凍存，凍存復(fù)蘇的原則是慢凍快融。
1．凍存細(xì)胞
（1）選對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞(證明無(wú)支原體污染)，在凍存前1d換液。
（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×10
6／m1左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO
3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點(diǎn)降低，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。
（4）分裝于無(wú)菌凍存管中，每管加1.5m1懸液。
（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，作好標(biāo)記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡(jiǎn)易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min時(shí)間內(nèi),下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成?；?qū)⒓?xì)胞凍存于-152℃冰箱。
操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免凍傷。
2. 復(fù)蘇細(xì)胞
細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化**37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。
(1) 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.將水浴鍋預(yù)熱**37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。
3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。(2)．取出凍存管：
1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)的凍存管。
2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。(3)．迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的36-37℃水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化，30～60s內(nèi)完成。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用70%酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi),打開蓋子,用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中,再滴加10 m1培養(yǎng)液。
(4)平衡離心：
用架盤天平平衡后，放入
離心機(jī)中3000r/min 離心3min或者低速離心(500～1000r／min) 5 min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
(5)制備細(xì)胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
(6)細(xì)胞計(jì)數(shù)：
細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。
(7)培養(yǎng)細(xì)胞
將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)(或者24-48小時(shí))后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。
初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：
1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。
2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。
3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致
離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。
4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。
5，凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達(dá)到10
7／m1，在融后稀釋20倍后，仍能保持5×10
5個(gè)／m1數(shù)量。
5
， 細(xì)胞計(jì)數(shù)
實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：
(1)準(zhǔn)備工作：
取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)(消化法)》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以被使用。
(2)細(xì)胞懸液制備：
細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液(或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液)，吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。
(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。
2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液(0.4％)或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。
3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻(每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻)中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：
(細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml＝ ( 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×2×104
說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。
公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。
公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：
1.0mm(長(zhǎng))×1.0mm(寬)×0.1mm(高)＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
(4)細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：
1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；
2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。
3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；
4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。
5. *作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。
(5)初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：
1. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。
2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
3. 滴入懸液時(shí)的量太多，**使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。
本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：
4％臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水**100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
使用液：使用時(shí)，用PBS稀釋母液**0.4％即可。
6用濾膜濾器過濾液體除菌
1、將濾膜放入去離子雙蒸水中浸泡。用鑷子取出濾膜，裝入小濾器中，扭緊后再松開一圈（不銹鋼濾器螺絲不要擰太緊）。高壓蒸氣滅菌，其后自然干燥。
2、使用前先擰緊小濾器，10ml注射器接上小濾器上口，加入2ml待濾液體，推上針芯，并保留數(shù)毫升氣體。推壓針芯，液體濾盡后，繼續(xù)適當(dāng)用力推壓，針芯有彈性并不能將氣體推盡，則表明此濾器濾膜是安裝完好的。
3、正式過濾待濾液體。濾完后再次推空氣，如有阻力，表明過濾過程中濾膜保持完好。打開小濾器，再次檢查濾膜是否完好。如果發(fā)現(xiàn)濾膜破損，應(yīng)重新過濾。
注：
1．小濾膜器使用方便，適于少量液體過濾（也可選用一次性濾器）；
2．有些有機(jī)物質(zhì)（如DMSO）可溶解濾膜，因而不能使用；
3．市場(chǎng)上有成品出售，可直接應(yīng)用，但仍應(yīng)在過濾前后用推注氣體的方法檢測(cè)濾膜是否完好；一些大分子蛋白質(zhì)可以粘在濾膜上，損失很大，可以先用少量血清或蛋白質(zhì)沖洗一下濾膜，可減少這種損失。
7，ph 對(duì)溶液的關(guān)系
酚紅，在ph7.4時(shí)，呈紅色；ph 7.0，呈橘紅絲；ph 6.5呈黃色；低于6.5為檸檬黃；ph7.6,呈桃紅色；ph7.8紫紅色。由于顏色的判斷具有較高的主觀性，因此制作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)色階很必要
ph標(biāo)準(zhǔn)色階的制備
材料：Hank's平衡鹽溶液（HBSS)，10倍濃縮液或粉劑，不含碳酸鹽或葡萄糖，含有20mmol/l HEPES
9個(gè)瓶子（大小與**長(zhǎng)使用的培養(yǎng)基或培養(yǎng)瓶相似），超純水，
滅菌的0.1mol/l 氫氧化鈉（用超純水配制，過濾除菌）
操作步驟：
1，配制ph6.5的BSS，分裝**7個(gè)大小適宜的瓶子中。
2，使之與空氣達(dá)到平衡
3，用無(wú)菌的0.1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph**6.8,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8以ph計(jì)測(cè)定。
4，將調(diào)節(jié)好的BSS過濾除菌，然后存放于培養(yǎng)瓶中
5，保持無(wú)菌和密封。
10，培養(yǎng)基的更換
需要更換的四個(gè)指標(biāo)：
（1）PH，當(dāng)ph從7.0降到6.5時(shí)大多數(shù)細(xì)胞就停止生長(zhǎng)；當(dāng)ph在6.5和6.0之間時(shí)細(xì)胞開始失去活性。如果培養(yǎng)基從紅色變成橙色，再變成黃色，那么就需要更換培養(yǎng)基了。可以通過顏色變化估計(jì)ph變化率，如果ph為7.0的培養(yǎng)物每天降低0.1ph單位，那么在換液前多放置一兩天沒什么關(guān)系，但若培養(yǎng)物每天降低0.4ph單位，那么需要在24-48h內(nèi)換液。
（2）細(xì)胞密度
（3）細(xì)胞類型：正常細(xì)胞如二倍體成纖維細(xì)胞在高密度時(shí)停止分裂，此時(shí)細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G1期，根據(jù)情況換液。
（4）形態(tài)衰退，通過長(zhǎng)期定期觀察形成經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷。
培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基的體積與表面積比通常為0.2-0.5ml/cm
2，其**適比例是由該細(xì)胞的需氧量決定，需氧量高的細(xì)胞在較淺的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好（如2mm），需氧量較低的細(xì)胞在較深的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好（如5mm）
更換培養(yǎng)基的無(wú)菌材料：
移液管，培養(yǎng)基
操作步驟：
（1）準(zhǔn)備好超凈工作臺(tái)，以70%乙醇浸泡的紗布擦拭超凈工作臺(tái)及實(shí)驗(yàn)所需的試劑及材料，并將擦拭過的試劑及材料立即放到超凈工作臺(tái)。
（2）仔細(xì)觀察培養(yǎng)物是否有污染或衰退跡象。
（3）考察上述判別是否需要更換培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)，即ph和細(xì)胞密度或濃度，如果需要?jiǎng)t按下不操作。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
(4)將培養(yǎng)物放于無(wú)菌工作區(qū)域
（5）吸除舊培養(yǎng)基
（6）加入同體積的新鮮培養(yǎng)基。**好將培養(yǎng)基預(yù)熱**37攝氏度。
（7）將培養(yǎng)物重新放回培養(yǎng)箱
注意：當(dāng)培養(yǎng)物密度過低或生長(zhǎng)緩慢時(shí)**好進(jìn)行半量換液，即在第5步僅僅吸出一半舊培養(yǎng)基，在第6步補(bǔ)入相同體積的新鮮培養(yǎng)基。
即使是高密度的細(xì)胞群體，更換培養(yǎng)基也會(huì)刺激細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，因此當(dāng)不需要有絲分裂時(shí)可使用維持培養(yǎng)基。維持培養(yǎng)基是血清濃度降**0.5%-2%或完全不加血清的常規(guī)培養(yǎng)基。
12，GIEMSA染色
GIMSA是一種多色的血涂片染料，進(jìn)行血圖片染色時(shí)，常與May-Grunwald染液結(jié)合使用，但不用于細(xì)胞的染色。染色后核呈粉紅或紫羅蘭色，核仁呈藍(lán)黑色，細(xì)胞質(zhì)呈淺灰藍(lán)色。所染細(xì)胞必須乙醇或甲醇固定，制備過程中必須徹底脫水，否則不能正常染色。
非滅菌材料：
PBSA; PBSA：甲醇（1:1）；未稀釋的GIEMSA染液；甲醇；去離子水
操作步驟：
1，吸去培養(yǎng)基
2，用PBSA沖洗單層細(xì)胞，去掉沖洗液
3，加入PBSA/甲醇液0.2ml/cm
2，靜置2min,然后去掉PBSA/甲醇液
4，加新甲醇5ml,靜置10min.
5, 棄掉甲醇液，用無(wú)水甲醇，沖洗單層細(xì)胞，去掉甲醇。
6，此時(shí)，培養(yǎng)瓶經(jīng)干燥可儲(chǔ)存，也可直接進(jìn)行染色。即使是干的培養(yǎng)瓶，用新配的無(wú)水甲醇沖洗后直接染色時(shí)非常重要的。如果甲醇倒出，培養(yǎng)瓶靜置了一段時(shí)間后，殘留的甲醇會(huì)吸收水分，從而妨礙下一步的染色。
7，加入純度GIEMSA染液，0,。08ml/cm
2,確保覆蓋整層細(xì)胞。
8,2min后，用8ml水稀釋染液，并輕輕晃動(dòng)2min.
9,用水置換染液，游走浮渣，用自來(lái)水沖洗細(xì)胞，直到去除片狀粉色本底（沉積），
10，將水倒掉，用去離子水沖洗，在單層細(xì)胞仍處于濕潤(rùn)狀態(tài)時(shí)，用顯微鏡觀察細(xì)胞，干燥，保存染色，觀察時(shí)應(yīng)重新使它濕潤(rùn)。
13，結(jié)晶紫染色
非滅菌材料：
PBSA;PBSA/甲醇（1:1）； 甲醇；結(jié)晶紫；過濾漏斗和濾紙，大小適合于每個(gè)培養(yǎng)皿中盛載5ml的染液；回收染液的瓶子。
操作步驟：
1，吸去培養(yǎng)基
2，用PBSA沖洗單層細(xì)胞，棄掉沖洗液
3，每25cm
2加入PBSA/甲醇 5ml,靜置2min,棄掉PBSA/甲醇
4，加入新甲醇5ml, 靜置10min
5,棄掉甲醇，將培養(yǎng)皿中的液體倒干凈，使其干燥
6，每25cm
2加入5ml結(jié)晶紫，靜置10min.
7,過濾漏斗放置在瓶上
8，將染液倒入漏斗
9，用自來(lái)水沖洗培養(yǎng)皿，然后用去離子水沖洗，干燥培養(yǎng)皿。
14，涂片制備
無(wú)菌材料：用50%-100%血清懸浮的濃縮細(xì)胞懸液；血清
非無(wú)菌材料：顯微鏡載玻片；甲醇；電扇
操作步驟：
1，在載玻片一端滴一滴血清，用第二張載玻片末端蘸取這滴血清，并在**張載玻片上移動(dòng)，在玻片表面形成一薄層血清。
2，用電扇使血清干燥
3，用50%-100%血清懸浮細(xì)胞，細(xì)胞濃度為10
6/ml,取一滴血清滴在載玻片一端，用第二張載玻片末端蘸取這滴細(xì)胞懸液，在**張載玻片上移動(dòng)，形成一薄層細(xì)胞的分布
4，迅速干燥載玻片，甲醇固定。
15
,染色體制備
固定阻滯在M期的細(xì)胞，在低滲培養(yǎng)基中會(huì)發(fā)生膨脹，將細(xì)胞滴在載玻片上，染色，觀察
無(wú)菌材料：
對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)細(xì)胞；用PBSA配制的10
-5mol/l 秋水仙胺；PBSA;0.25%的粗提胰蛋白酶
非滅菌材料：
低滲溶液：0.04mol/l KCL; 0.025mol/l 枸櫞酸鈉；醋酸甲醇固定液；一份冰醋酸加三份無(wú)水甲醇或乙醇，新鮮配制并在冰上保存；Giemsa染液；DPx或permount 封固劑；冰；離心管；巴斯德吸管；載玻片；蓋玻片#00；載玻片盒；低速
離心機(jī)；渦流混懸器。
操作步驟:
1,將細(xì)胞濃度為2 x 10
4 ** 5 x 10
4/ml的培養(yǎng)液20ml放入75cm
2的培養(yǎng)瓶（每平方厘米4 x 10
3**1 x10
4個(gè)細(xì)胞）中培養(yǎng)。
2，約3-5天后，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以1：100（v:v)加入1 x10
-5mol/l秋水仙胺（終濃度1 x 10
-7）于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)已有的培養(yǎng)基中。
3,4-6h后，輕輕去掉培養(yǎng)基，加5ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育10min.#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
4,胰蛋白酶西鄰懸浮細(xì)胞，棄掉上清液中胰蛋白酶。
5，以5ml低滲溶液重新混懸細(xì)胞，37℃，靜置20min.
6,加入等量新鮮配制的冰冷的醋酸甲醇，不停地混合，然后以100g速度離心2min
7,棄掉上清混合物，在渦流混懸器上振蕩細(xì)胞團(tuán)塊，再慢慢邊混勻邊加新制備的醋酸甲醇。
8，細(xì)胞在冰上靜置10min.以100g速度離心細(xì)胞2min.
9,棄掉上清中的醋酸甲醇，在0.2ml的醋酸甲醇溶液中重新振蕩以混懸細(xì)胞團(tuán)（例如，將試管底部置于振蕩器上），直到細(xì)胞均勻分散。
10，用吸管吸一滴細(xì)胞懸液到吸管尖部，從30cm處滴到?jīng)龅牟Ｆ?，傾斜玻片，讓流滴流下并鋪開。
11，將玻片在燒杯的沸水上迅速干燥，然后用相差顯微鏡觀察。如果細(xì)胞均勻鋪展而沒有相互接觸，則以同樣濃度的細(xì)胞制備更多片子。如果細(xì)胞成堆重疊出現(xiàn)，則稀釋懸液2-4倍之后，再準(zhǔn)備一張滴液玻片。
12，進(jìn)行Giemsa細(xì)胞染色：
將玻片浸入純凈的染液中2min; 將染色缸放在水池中，加入大約10倍體積的水，讓過多的染液從玻片染色缸的頂端溢出；玻片靜置2min;用自來(lái)水置換出其余染液，然后用自來(lái)水逐張沖洗玻片去除染液沉淀（使玻片上呈現(xiàn)粉紅色，不透明的外觀）；顯微鏡下觀察染色情況，對(duì)于滿意的則將載玻片徹底干燥，用#00蓋玻片及DPX或Permount封片。
16，清潔培養(yǎng)箱
非滅菌材料
水中含有2%新吉爾滅或類似的真菌抑制劑，將上述水溶液注入水盤中；替代的CO2溫箱或塑料盒和封口的膠帶；去污劑（10%新吉爾滅或另一種滅菌去污劑，70%乙醇）
操作步驟：
1，將全部培養(yǎng)物移**另一個(gè)二氧化碳溫箱；或包裝培養(yǎng)物，并通CO2，然后將其放置在普通培養(yǎng)基或溫室中。
2，將準(zhǔn)備清潔的溫箱斷開電源
3，將溫箱中所有的隔板及水盤和可拆卸的部件取出
4，用含有去污劑的溶液清洗溫箱內(nèi)部，盡可能擦抹每個(gè)角落及縫隙處
5，用清水沖洗
6，用70%乙醇擦洗溫箱內(nèi)部
7，在保持門打開的狀態(tài)下，加熱（不是加CO2）直**溫箱干燥。
8，用去污劑擦洗隔板及各部件，然后用清水沖洗，用70%乙醇擦洗
9，將隔板及各種部件放回溫箱中
10，放回水盤，注入含有2%新吉爾滅的水
11，關(guān)門和接通CO2氣體
12，當(dāng)溫度和CO2已趨于穩(wěn)定，將培養(yǎng)物放回溫箱。
17細(xì)胞培養(yǎng)的疑難解析
1，
培養(yǎng)基的ph值變化迅速：
（1） CO2分壓設(shè)置錯(cuò)誤：應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中碳酸氫鈉的濃度降低或升高培養(yǎng)箱中CO2分壓，當(dāng)碳酸氫鈉的濃度在2.0-3.7g/l，應(yīng)相應(yīng)的使用5%**10%的二氧化碳分壓。
（2） 組織培養(yǎng)瓶蓋的過緊：應(yīng)將蓋子懸松1/4圈。
（3） 碳酸氫鹽的緩沖能力不足：應(yīng)加入HEPES緩沖液，使其**
終濃度為10-25mM
(4) 細(xì)菌、酵母或真菌污染
2， 細(xì)胞無(wú)法在培養(yǎng)器皿上貼壁
（1） 胰蛋白酶消化過度：應(yīng)縮短胰蛋白酶的消化時(shí)間，或者減少用量
（2） 支原體污染：隔離培養(yǎng)物，檢測(cè)其是否感染支原體，清除通風(fēng)櫥和培養(yǎng)箱。
(3) 培養(yǎng)基中無(wú)附著因子。
3， 懸浮細(xì)胞聚集在一起：
（1） 存在鈣離子和鎂離子：用不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液沖洗細(xì)胞。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。
（2） 支原體污染：隔離培養(yǎng)物，檢測(cè)其是否感染支原體。清除通風(fēng)櫥和培養(yǎng)箱。如果培養(yǎng)物被污染，則丟棄。
（3） 蛋白酶消化過度，細(xì)胞裂解釋放DNA.
4， 原代細(xì)胞培養(yǎng)被污染;
(1) 殘留的原代組織將培養(yǎng)物污染：培養(yǎng)前，用含有較高濃度抗生素和抗真菌劑的平衡鹽溶液清洗組織碎片數(shù)次。
5， 培養(yǎng)物生長(zhǎng)緩慢：
（1） 培養(yǎng)基或血清改變：比較不同培養(yǎng)基配方中葡萄糖和氨基酸及其他成分有無(wú)差異；通過生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)比較新老批次血清有無(wú)差異；增大細(xì)胞初始接種密度。
（2） 必需生長(zhǎng)促進(jìn)成分（如：L-谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子）耗竭，缺乏或分解：去除原培養(yǎng)基加入新培養(yǎng)基。
（3） 輕度細(xì)菌或真菌污染：在不加抗生素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如果污染物被污染，則丟棄。
（4） 試劑儲(chǔ)存不當(dāng)：血清應(yīng)在-5℃**-20℃下儲(chǔ)存。完全培養(yǎng)基應(yīng)在2℃到8℃下避光儲(chǔ)存，**長(zhǎng)可使用兩周。盡量減少血清和培養(yǎng)基見光時(shí)間。
（5） 細(xì)胞初始接種密度過低?；蛴邢夼囵B(yǎng)物衰老。
（6） 支原體污染。
6， 培養(yǎng)物死亡
（1） 培養(yǎng)箱中無(wú)二氧化碳：檢測(cè)培養(yǎng)箱中二氧化碳使用速度，以便確定何時(shí)更換氣瓶。經(jīng)常檢查管路連接處是否漏氣，不要頻繁開啟培養(yǎng)箱門。
（2） 培養(yǎng)箱中溫度有波動(dòng)。
（3） 抗生素濃度過大，培養(yǎng)基的滲透壓不合適。
7， 細(xì)胞污染應(yīng)對(duì)：#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
§ 培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。
§若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。
一、細(xì)菌和真菌的清除
§1、使用抗生素
§抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。
§預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。
（二）、支原體的清除
§１、用MRA處理
§用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康．效果好．
§2、用清洗純化法清除支原體污染的方法
§細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌 ，其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低**極限. §如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。
§3、藥物輔助加溫處理
§先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。
４、使用支原體特異性血清
§用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。 但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。
（四）、污染的預(yù)防
§預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的**好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到**小程度。
§一般預(yù)防可從以下幾方面著手：
1、添加抗生素
2、從物品、用品消毒滅菌著手
§細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無(wú)菌試驗(yàn)陰性后才能使用。 操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔消毒滅菌。
3、從操作者做起
§（1）進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
§（2）操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無(wú)菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。
§（3）操作時(shí)要常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。
4、防止細(xì)胞交叉污染
§在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。
§在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。
§細(xì)胞一旦購(gòu)置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。
５、無(wú)菌室的徹底消毒
§1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無(wú)菌室；
§2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對(duì)各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。
Invitrogen細(xì)胞培養(yǎng)污染策略：
1， 如果無(wú)法替換的培養(yǎng)物受到污染，研究人員可以嘗試消除或控制污染。shou先應(yīng)確定污染物是細(xì)菌，真菌，支原體或是酵母。將受污染的培養(yǎng)物與其他細(xì)胞系隔離，使用實(shí)驗(yàn)室消毒劑清洗培養(yǎng)箱和層流通風(fēng)處。并檢查HEPA濾器。
2， 高濃度的抗生素和抗真菌劑會(huì)對(duì)一些細(xì)胞系產(chǎn)生毒性，因此應(yīng)進(jìn)行劑量效應(yīng)試驗(yàn)，確定抗生素或抗真菌劑產(chǎn)生你毒性的劑量水平。以下為建議操作程序：
（1），解離和計(jì)數(shù)細(xì)胞，用無(wú)抗生素培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞。漿細(xì)胞稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代用的濃度。將細(xì)胞懸液移入多孔培養(yǎng)板或者數(shù)只小培養(yǎng)瓶中。將所選的抗生素以一系列的濃度分別加入各個(gè)孔或培養(yǎng)瓶中。
（2）每天觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)中毒征象如脫落，出現(xiàn)空泡，融合度降低和細(xì)胞變圓。
（3）確定抗生素的毒性水平后，以此濃度的三分之一或二分之一為抗生素使用濃度，進(jìn)行2到3代的細(xì)胞培養(yǎng)。
(4)將細(xì)胞在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，重復(fù)第三步，
(5)將細(xì)胞在無(wú)抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)4**6代，以確定污染是否已經(jīng)消除。
3，抗生素建議使用的濃度如下：
Fungizone(兩性霉素B) 0.25-2.5μg/ml, 針對(duì)于真菌及酵母37℃培養(yǎng)基中可以維持3天穩(wěn)定性。
硫酸慶大霉素 5-50μg/ml G+,G- 支原體 穩(wěn)定5天
硫酸卡那霉素 100μg/ml G+, G-,支原體 5天穩(wěn)定
青霉素 50-100單位/ml G+ 3天穩(wěn)定#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
硫酸鏈霉素 50-100μg/ml G+,G- 3天穩(wěn)定
