ES 細(xì)胞培養(yǎng)

A.FBS的滅活與分裝
1.化凍
將血清（Fetal Bovine Serum，Hyclone）從－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化凍過夜；也可室溫（或浸于自來水中）化凍，化凍后若不馬上滅活，可以放入4℃冰箱暫時保存；
 
2.滅活
 
（1） 放入室溫的水浴鍋內(nèi)開始加熱（同時放入一個內(nèi)裝200 ml自來水的血清瓶，插入一根溫度計，溫度監(jiān)控以此為準(zhǔn)）；
（2） 當(dāng)溫度計顯示56℃時，控制在此溫度30分鐘±3分鐘；若不小心使溫度上升超過56℃，則：若仍未超過60℃，且時間很短（比如：不超過5分鐘），則仍可使用；若超過60℃，或者時間較長，則棄去不用，或者嘗試用于ME細(xì)胞的培養(yǎng)；
（2） 取出，自然冷卻**室溫（約需1－3小時），可分裝或－20℃繼續(xù)凍存；
 
3.分裝
 
（1）轉(zhuǎn)入細(xì)胞間，用移液器將血清分裝，注意預(yù)先要將血清輕輕搖動數(shù)周、混勻；吹出血清時要注意：不要吹出氣泡（血清很粘稠，很容易產(chǎn)生氣泡；如果已產(chǎn)生氣泡，則在酒精燈火焰上過一下）；標(biāo)好批號和日期；
（2）放入－20℃冰箱凍存(分裝一次大約可以使用1—2個月)。
 
B. 配制DMEM血清培養(yǎng)基
1.提前**將分裝好的FBS從—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化凍；
2.在細(xì)胞間中將FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸鈉、抗生素等），按照比例加入DMEM培養(yǎng)基中，作好標(biāo)簽；放入4℃冰箱保存。
配制比例如下：
 

C.原代胚胎成纖維細(xì)胞（ME）的制備
1. 取12.5-13.5dpc孕鼠，斷頸處死；
2. 將鼠腹面向上放置，70% 酒精潤濕、消毒腹部（防止腹毛飛揚(yáng)，污染內(nèi)臟及子宮），剪開皮膚層、肌肉層，打開腹腔，將連接在子宮上的結(jié)締組織及脂肪剪去，將子宮取出，轉(zhuǎn)入無菌10cm平皿中；
3. 把平皿轉(zhuǎn)入超凈臺；
4. 用鑷子打開子宮壁，擠出鼠胚，并與胚外組織、胎盤等分離，除去鼠胚的頭、四肢及各種內(nèi)臟（主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等）；
5. 將鼠胚移入另一新的無菌皿，用PBS洗三次；
6. 棄去PBS，用彎頭剪將鼠胚剪碎，加入PBS洗**溶液基本無色（1－4次）；
7. 加入適量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），體積約等于組織塊體積；
8. 用滴管輕輕吹勻，室溫下消化1－10分鐘（或消化**溶液渾濁變粘），加入與消化液等體積培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻（5－10次），靜置；
9. 沉降后將上部溶液輕輕吸出，轉(zhuǎn)入離心管中。
10. 將細(xì)胞懸液管離心（1000轉(zhuǎn)5分鐘）；
11. 棄去上清，向沉淀中加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸，將其分種**10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，作標(biāo)簽（ME－0；注意：若凍存，則可以使用復(fù)蘇后的0代ME制作Feeder；若直接使用則**好不用0代ME細(xì)胞做Feeder，要傳到一代以后再用來制作Feeder比較好），轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
12. 視細(xì)胞生長情況換液（一般3天換液一次），若細(xì)胞已長滿，則凍存，或者1：3-5傳代（視細(xì)胞疏密而定），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（此后不用再換液）；1－5代的ME細(xì)胞均可用來制作Feeder。#p#分頁標(biāo)題#e#
 
飼養(yǎng)層細(xì)胞（Feeder）的制備
注：含10 ug/ml絲裂霉素C的DMEM血清培養(yǎng)基（FBS占10%）（實(shí)驗(yàn)室所用MMC為10 mg/mL，Calbiochem）
 
1.棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入適量含10ug/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS）；
2. 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3小時（2－4小時）；
3. 用0.1% 明膠處理培養(yǎng)皿（將明膠加入，搖動使明膠覆蓋全部皿底，然后吸出明膠棄去即可），室溫放置2小時以上，**皿底明膠干燥為止；
4. 棄去含有絲裂霉素C的培養(yǎng)基，加入2－3 mL PBS，輕輕搖動，棄去PBS，如此洗3-5次（必須洗3次以上，以便徹底洗去殘存的絲裂霉素，絲裂霉素是有絲分裂抑制劑，因而對ES細(xì)胞有毒性）；
24. 加入適量胰酶消化30秒，吸去消化液，靜置**細(xì)胞層出現(xiàn)裂縫或明顯滑壁為止，加入培養(yǎng)基，吹打，種**明膠處理過的培養(yǎng)皿中即可（如細(xì)胞過稀，可再補(bǔ)加絲裂霉素處理過的細(xì)胞），半小時后即可使用（如果急用，則可以用ES細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，然后與ES細(xì)胞一起轉(zhuǎn)入明膠處理過的新板上），可使用6－10天，用前更換培養(yǎng)液（如未用明膠處理培養(yǎng)皿，則需在培養(yǎng)箱中放置2小時以上方可使用；**好是前**下午制作Feeder，第二天上午使用，這時的Feeder狀態(tài)**好，**適于ES細(xì)胞貼壁生長，而且萬一制作的Feeder在第二天早上發(fā)現(xiàn)出了問題，還可以趕緊補(bǔ)做）。
 
ES細(xì)胞培養(yǎng)基
DMEM+15%FBS  
FBS：   gibco Fetal Bovine Serum, ES Cell-Qualified 500ml 10439-024
2-巰基乙醇：5.5uM 1000X Gibco 21985-023
L-谷氨酰胺：2mM 100X Sigma G8540   GluMAX 35050-061(GIBCO)
LIF：1000U/mL 10000X Chemicon ESGRO® (LIF); 10E7 units，貨號:ESG1107
非必需氨基酸：100uM 100X Gibco 11140-050
雙抗： 100X Gibco 15070-063
丙酮酸鈉                100x    Gibco 11360-070
絲裂霉素：   sigma M4287-2MG 1330.29  M4287-5X2MG 5875.74
明膠：sigma G9391 G1393 gelatin solution
胰酶 gibco 15400-054
PBS：14190-144 gibco
TrypLE™ - Phenol Red   gibco 500ml 12605-028
DMSO     sigma C6164-50ML
ES細(xì)胞的復(fù)蘇
1. 提前制備好相應(yīng)數(shù)量的Feeder；
2. 準(zhǔn)備37－39℃的熱水，從液氮罐中取出所需凍存管（凍存細(xì)胞），迅速投入熱水中，迅速劇烈搖動直**凍存液全部融化；
3. 轉(zhuǎn)入無菌間，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘；
4. 棄上清，加入1 ml ES培養(yǎng)液輕輕吹打重懸，轉(zhuǎn)入鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中（凍存前細(xì)胞來自多大的培養(yǎng)皿，復(fù)蘇時就用相應(yīng)大小的培養(yǎng)皿），補(bǔ)加適量培養(yǎng)液；
5. 轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液；此后每24小時換一次液，每48小時傳一次代（視生長情況）。
 
ES細(xì)胞的換液
1. 提前半小時左右將培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內(nèi)）；
2. 細(xì)胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，相差顯微鏡下作常規(guī)觀察（判斷生長情況，并確證未發(fā)生污染）后轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)；
3. 將ES細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，換新鮮培養(yǎng)基（6 cm培養(yǎng)皿約5 mL，3.5 cm培養(yǎng)皿約3 mL培養(yǎng)基；若死細(xì)胞較多則可以先用PBS洗一次，再加培養(yǎng)基）；
4. 放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
 
ES細(xì)胞的傳代
1. 前**下午做好所需數(shù)量的Feeder細(xì)胞板；
2. 提前半小時左右將培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內(nèi)）；
3. 將ES細(xì)胞培養(yǎng)皿、Feeder細(xì)胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出（相差顯微鏡下作常規(guī)觀察，F(xiàn)eeder細(xì)胞應(yīng)生長良好，細(xì)胞覆蓋95%左右，**少90%以上的培養(yǎng)皿面積）；ES細(xì)胞應(yīng)生長良好，接近長滿培養(yǎng)皿，細(xì)胞集落大小一致、疏密均勻，集落形狀規(guī)則、呈橢圓形、邊緣光滑、表面光滑，細(xì)胞生長致密、核大、胞質(zhì)少；
4. 將ES細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用約30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，棄去；再作用1—5分鐘，不時觀察，待細(xì)胞層（皿底一層白色臟東西樣膜）出現(xiàn)裂縫并明顯開始下滑時，補(bǔ)加培養(yǎng)基，適度吹打（視消化程度及管口粗細(xì)而定，**看不到明顯的大的細(xì)胞團(tuán)塊為止）；平均分到Feeder培養(yǎng)皿中（滴加，以免將Feeder細(xì)胞吹脫落下來），滴加補(bǔ)加培養(yǎng)基**5 ml左右（滴加，以免將Feeder細(xì)胞吹脫落下來；若為3.5cm培養(yǎng)皿，則補(bǔ)加**3ml左右），作好標(biāo)簽；
5. 前后左右水平晃動培養(yǎng)皿，使ES細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
 
ES細(xì)胞的凍存
1. 常規(guī)方法將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液；
2. 轉(zhuǎn)入試管，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘；
3. 配適量凍存液（為含10% 二甲亞砜（DMSO），10% FBS的DMEM培養(yǎng)液）；
4. 棄上清，每管加入1ml凍存液，吹打成細(xì)胞懸液（只要使ES細(xì)胞分散成3—5個細(xì)胞的小團(tuán)塊即可），轉(zhuǎn)入凍存管，作好標(biāo)簽；
5. 放入程序凍存盒內(nèi)24小時后轉(zhuǎn)入液氮罐中凍存。