實(shí)驗(yàn)一 清洗與滅菌
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過(guò)除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理 清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的**步，是組織培養(yǎng)中工作量**大，也是**基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無(wú)菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無(wú)油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留0．1個(gè)，也可能影響細(xì)胞生長(zhǎng)。滅菌手段的選擇十分重要，對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了無(wú)菌卻使被滅菌藥品喪失了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。
三、實(shí)驗(yàn)材料、用品
1．材料：無(wú)臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0．22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0．22 μm，過(guò)濾器(直徑25)。
2．藥品：70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來(lái)蘇兒水)，0．5％過(guò)氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))。
3．儀器：超凈臺(tái)，干燥箱，高壓蒸氣滅菌鍋，過(guò)濾器，過(guò)濾泵。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
(一)清洗
1．新玻璃器皿的清洗先用自來(lái)水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。
2．使用過(guò)的玻璃器皿的清洗
(1)使用過(guò)的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。
(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來(lái)水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液過(guò)夜。
(4)從酸性洗液撈出后自來(lái)水沖洗10．15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包裝(牛皮紙或一般紙)。
(6)高壓(15磅20 min)或干熱(170℃2 h)滅菌。
(7)貯存?zhèn)溆谩?br /> 3．膠塞的處理
(1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸l(wèi)O-20 min。
(2)自來(lái)水清洗10次。
(3)再用1％稀鹽酸浸泡30 min。
(4)自來(lái)水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌(見(jiàn)(二)消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過(guò)蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。
（二）消毒
1．物理消毒法
(1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺(tái)面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。
(2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱**160℃，保溫90－120 min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需180℃，保溫5－8 h。
(3)濕熱滅菌 此方法也稱(chēng)為高壓蒸汽滅菌，是**有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類(lèi)、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無(wú)機(jī)溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。
(4)濾過(guò)除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號(hào)按直徑大小劃分。如過(guò)濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號(hào)的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以過(guò)濾泵使用。過(guò)濾量較小的液體常用注射器推動(dòng)的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌**為保險(xiǎn)，但對(duì)于較粘稠難濾過(guò)的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。
2．化學(xué)消毒法
常用的消毒液有如下幾種：
(1)70％(或75％)酒精：超凈臺(tái)里常備70％酒精棉球(衛(wèi)生級(jí)酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺(tái)面的消毒。
(2)0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺(tái)面的清潔。超凈臺(tái)旁應(yīng)常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。
(3)來(lái)蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無(wú)菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請(qǐng)按瓶上說(shuō)明。
(4)0．5％過(guò)氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行。
(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱**沸騰為止。將門(mén)窗緊閉1—3 d。可將空氣中漂浮的微生物殺死。
(6)37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門(mén)窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱**沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達(dá)到消毒空氣的目的。
3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。
五、注意事項(xiàng)
1．清洗玻璃制品時(shí)，浸酸之后一定要用自來(lái)水沖洗10—15次。因?yàn)闅埓娴南匆簩?duì)細(xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時(shí)要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬(wàn)不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個(gè)清洗。如沒(méi)有洗凈會(huì)影響下一次使用的效果。
2．干熱滅菌時(shí)，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過(guò)100℃時(shí)，不能再打開(kāi)烤箱門(mén)。器皿烤完后，待溫度降**100℃之下才能開(kāi)烤箱門(mén)。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。．#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
3．高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。
4．牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。
5．濾過(guò)除菌時(shí)，濾器在使用前先裝好濾膜(有時(shí)可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過(guò)酶類(lèi)制劑時(shí)應(yīng)待濾器溫度降**室溫下再進(jìn)行。過(guò)濾時(shí)壓力不宜過(guò)大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時(shí)微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過(guò)濾膜。裝濾膜時(shí)位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時(shí)，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。
6．使用化學(xué)消毒法時(shí)，配制75％酒精應(yīng)用衛(wèi)生級(jí)，不要用化學(xué)純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來(lái)蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對(duì)皮膚有刺激性。空氣消毒時(shí)，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因?yàn)榧兹┗蛉樗峒訜岷蠓懦龅恼魵鈱?duì)人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。
實(shí)驗(yàn)二、原代培養(yǎng)
原理 將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱(chēng)原代培養(yǎng)。     
儀器、材料及試劑 ：培養(yǎng)箱（調(diào)整**37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37℃） 材料：動(dòng)物組織塊   試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒20分鐘。開(kāi)始工作前先洗手、75%酒精擦拭手**肘部。
2. 布局：點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽。
3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。
4. 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。
5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。
6. 分離：在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊。低速（500~1000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。
7. 計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過(guò)大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，pH要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說(shuō)明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。
8. 培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需要換新塞。
初代組織塊培養(yǎng)法
1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。
2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。
3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時(shí)勿另組織小塊流動(dòng)，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時(shí)左右（勿超過(guò)4小時(shí)），使小塊微干涸。
4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開(kāi)塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補(bǔ)加培養(yǎng)液。
實(shí)驗(yàn)三、傳代培養(yǎng)法
原理 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)
也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
實(shí)驗(yàn)材料與試劑  
（1）材料： 原代培養(yǎng)細(xì)胞。
（2）設(shè)備與用品：倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，過(guò)濾器及0.22μm的水相濾膜，細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液管，吸管，小試管，酒精燈，試管架等。
（3）藥品與試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基；小牛血清； 0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS緩沖液或D-Hanks緩沖液配制，pH7.4）。
l 強(qiáng)酸洗液的配制：先用約200mL蒸餾水充分加熱溶解重鉻酸鉀63克，再緩緩加入1L濃硫酸并不斷攪拌，充分混合溶解。洗液腐蝕性較強(qiáng)，操作時(shí)注意做好各方面的防護(hù)，并且動(dòng)作要輕柔，注意安全。當(dāng)洗液的顏色由棕紅色變?yōu)榫G色時(shí)表明已經(jīng)失效，需重新配制。
4. 實(shí)驗(yàn)方法與步驟
l 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀察及細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
（1） 培養(yǎng)基等的配制及實(shí)驗(yàn)用品的清洗與消毒
配制RPMI-1640培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS緩沖液配制pH7.4）溶液，并過(guò)濾除菌后培養(yǎng)驗(yàn)菌。清洗，包裝并高壓滅菌細(xì)胞培養(yǎng)的玻璃用品等。細(xì)胞培養(yǎng)的玻璃器皿等進(jìn)行初步清洗后要用強(qiáng)酸洗液浸泡過(guò)夜，然后用蒸餾水徹底沖洗干凈；進(jìn)行濕熱滅菌時(shí)一般需**少滅菌40分鐘；培養(yǎng)過(guò)污染細(xì)胞的培養(yǎng)瓶則**好加上用煤酚皂溶液浸泡過(guò)夜的步驟；移液管和吸管在包裝前要在其管口用細(xì)絲或鑷子塞上少許棉花，長(zhǎng)約1~1.5cm，松緊要適宜。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
（2）動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察
倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)及密度，根據(jù)細(xì)胞密度決定傳代的稀釋倍數(shù)。同時(shí)可對(duì)比觀察教師事先準(zhǔn)備的污染細(xì)胞、死亡細(xì)胞，并對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的密度有一定感性的認(rèn)識(shí)。
（3）消化：倒掉舊培養(yǎng)基，加幾滴胰酶潤(rùn)洗一下，立即倒掉，再加適量胰酶消化1~2分鐘左右，可鏡下觀察待細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間空隙變大時(shí)立即停止消化。
（4）懸浮細(xì)胞：沿著培養(yǎng)瓶無(wú)細(xì)胞的一面倒掉胰酶，加適量培養(yǎng)基，用吸管充分吹打后，鏡下觀察是否還有貼壁細(xì)胞。
（5）分裝：一般以1：2或1：3進(jìn)行分裝，即一瓶細(xì)胞可傳為2~3瓶。向分裝好的各瓶細(xì)胞中再加入適量的含10%（v/v）血清的RMBI-1640培養(yǎng)液。
（6）擰上蓋子（勿擰緊），做好標(biāo)記，將培養(yǎng)瓶平放于培養(yǎng)箱中，于 37℃，5%CO2下培養(yǎng)。
5. 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
（1）要保證實(shí)驗(yàn)中的無(wú)菌操作，就必須特別注意一些操作上的細(xì)節(jié)，比如：培養(yǎng)液等不要過(guò)早開(kāi)瓶；加液時(shí)取液用的移液管、吸管勿碰用過(guò)的培養(yǎng)瓶瓶口；要勤過(guò)火焰，尤其是瓶口；手要握在移液器刻度之上的位置；超凈臺(tái)中物品的擺放要合理，盡量避免雙手交叉取物；若有動(dòng)作失誤，勿存僥幸心理，應(yīng)及時(shí)更換移液管等。
（2）對(duì)于貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)胰酶的消化步驟是關(guān)鍵，要注意胰酶消化的時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng)，否則不但造成細(xì)胞數(shù)目的損失，也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，使細(xì)胞不易貼壁生長(zhǎng)。
（3）可根據(jù)細(xì)胞的密度，生長(zhǎng)速度及實(shí)驗(yàn)周期的要求等適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞的接種密度。但細(xì)胞若接種密度過(guò)低，也會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)極為緩慢甚**停止生長(zhǎng)。