一、 實驗準(zhǔn)備
器材
液氮冷凍灌、 恒溫培養(yǎng)箱、 電冰箱、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、 離心機、 分析天平、倒置顯微鏡、 超凈工作臺、彎頭吸管（1個）、膠頭滴管（9個）、  離心管（9個）、 帶塞培養(yǎng)瓶（不定個）、 試管架、 量桶、 燒杯、酒精燈、 抽濾瓶、G6型號細(xì)菌過濾漏斗、帶塞小玻璃瓶，大三角瓶 、無菌凍存管、液氮瓶
（一）、器皿
1玻璃器皿的清洗滅菌：
種類：小玻璃瓶、彎頭吸管、滴管（3個）、培養(yǎng)瓶、量桶、 燒杯、抽濾瓶、大三角瓶，細(xì)菌過濾器接口管
藥品：5％鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml
（1）浸泡:新使用或重復(fù)使用的玻璃器皿須經(jīng)5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。以去除新購進(jìn)玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質(zhì)，并消除其弱堿性。
（鏡頭一：實驗人員將器皿放進(jìn)加有5％鹽酸溶液的盆內(nèi)，并以字幕和配音的形式顯示浸泡或煮沸時間和浸泡目的）
（2）刷洗:浸泡后用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)的洗潔精進(jìn)行刷洗。刷洗后經(jīng)行烘干
（鏡頭二：實驗人員刷洗器皿，使用正規(guī)的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3種即可，實驗人員必須介紹操作示范烘干箱的使用方法和相關(guān)數(shù)據(jù)的設(shè)置方法）
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當(dāng)晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。清潔液具有極強酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。
（鏡頭三：帶好橡膠手套將清潔液加入到盆中，讓后進(jìn)行酸浸，并以字幕的形式顯示浸泡時間）
（4）沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復(fù)10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次
將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干凈透明，無油煙，不能殘留任何有害物質(zhì)及化學(xué)藥品等。
（鏡頭四：自來水沖洗，蒸餾水清洗，烘干一起完成，在這個過程中可在裝器皿的盤中放入一定量的玻璃器皿，只對其中一種進(jìn)行自來水沖洗、蒸餾水清洗，洗好后就將所有儀器放入烘干箱中烘干，并在每一個步驟中以字幕或語音的形式顯示相關(guān)操作次數(shù)和時間）
（5）包裝滅菌:器材經(jīng)清洗烤干或晾干后，先應(yīng)嚴(yán)格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。
（鏡頭五：實驗人員對實驗器皿中的1—2種進(jìn)行包裝示范，然后將其他包裝過的器皿一起放入高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌）
（實驗人員必須示范操作高壓滅菌鍋和恒溫干燥箱的用法，示范操作步驟，只示范一次即可，在下面的不同滅菌溫度和不同滅菌時間可以字幕的形式顯示）
2、橡膠制品清洗消毒
種類：玻璃瓶橡膠塞、培養(yǎng)瓶瓶塞、皮管、滴管頭
新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用
（鏡頭：0.5mol/L NaOH煮沸，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘各一個鏡頭，因為在上面已經(jīng)示范過干燥箱和滅菌鍋的操作方法，在使用干燥箱和高壓滅菌時只需以字幕的形式顯示烘干溫度、滅菌溫度、滅菌時間即可）
 
3、塑料制品的清洗消毒
種類：瓶蓋、離心管
塑料制品特點：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。
（因在器皿的準(zhǔn)備過程中玻璃制品是**主要的，故塑料制品的清洗和消毒滅菌的方法可用字幕的方法顯示出來）
（注意：各種不同材質(zhì)器具的不同滅菌時間？溫度設(shè)置？）
2、試劑準(zhǔn)備
試劑 ：RPMI l640培養(yǎng)液, 小牛血清（生長因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇（消毒）,凍存培養(yǎng)液（培養(yǎng)液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS緩沖液等。
重點配置的藥品：RPMI l640培養(yǎng)液、0.2%胰蛋白酶液。
藥品：RPMI l640 培養(yǎng)粉、雙蒸水、HEPES、碳酸氫鈉、青霉素、鏈霉素；typsin粉末。
器材：大三角瓶、移液槍及槍頭、無菌EP管、無菌室、無菌操作臺、磁力攪拌器、G6型號細(xì)菌過濾漏斗、細(xì)菌過濾漏斗、冰箱。
 
（1） RPMI l640基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配制 ：
稱取RPMI l640 培養(yǎng)粉 10.4g溶于1,000 mL雙蒸水中,磁力攪拌器攪拌40min. 加HEPES 2、4g。攪拌十分鐘，2g碳酸氫鈉 攪拌十分鐘 。過濾前要加雙抗  加入雙抗****終濃度為 100單位/mL。過濾 
經(jīng)G6型號細(xì)菌過濾漏斗抽濾后備用
1、取RPMI l640培養(yǎng)粉10.4g，加入1L雙蒸水于磁力攪拌器下攪拌40min
2、加入HEPES 2、4g，再次攪拌溶解10min，再加入2g碳酸氫鈉，攪拌十分鐘（每一步一個鏡頭一個配音說明即可，每一步驟6s左右時間）#p#分頁標(biāo)題#e#
3、無菌實驗室打開紫外燈，紫外滅菌30min（可配音說明，6s左右）
4、人工消毒準(zhǔn)備，無菌操作臺酒精擦拭滅菌
（鏡頭：實驗人員穿上無菌實驗室操作服用戴上橡膠手套，然后就位用酒精棉球消毒試驗臺）
5、將滅過菌的細(xì)菌過濾器進(jìn)行組裝
    （鏡頭：細(xì)菌過濾器的滅菌時間和滅菌溫度可以配音或字幕的形式顯示）
6、在無菌工作臺上在培養(yǎng)基中加入雙抗，并混勻，配成各100單位/ml雙抗，混合后經(jīng)行細(xì)菌過濾器過濾，并示范操作
7、將滅過菌的小玻璃瓶于試驗臺上解封，取下封口紙，將小玻璃瓶瓶口于酒精燈上過火，分裝培養(yǎng)基，裝好后再次過火，用過火后的橡膠塞塞緊，并編號，寫上配置時間和配置人（每瓶90ml，只示范一個即可）
8、將封裝好的培養(yǎng)液放入4℃冰箱中存放備用。
（在這幾個步驟中每一步均以10s左右的視頻時間演示，再加上培養(yǎng)，然后切入下一個步驟）                                                                                                                                                                                                                                                                                           
（2）胰酶的配制： 稱取適量typsin粉末配制成0.1%--0.25%的濃度（0.006gtypsin粉末+3ml 雙蒸水），配制時要使用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如D-hank's溶液），因為這些物質(zhì)都會對胰酶產(chǎn)生抑制作用，胰酶無菌過濾時胰酶量多不銹鋼過濾，量少時用抽提過濾 。
二 、實驗臺準(zhǔn)備，實驗人員就位
消毒劑:操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用碘酒、酒精消毒。無菌室內(nèi)桌椅和物體的消毒可用過氧乙酸、來蘇兒等擦拭或浸泡。
紫外線：主要用于消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進(jìn)無菌室前或做完實驗后，均應(yīng)開燈照射30min進(jìn)行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細(xì)菌。
（鏡頭：在紫外線燈照射下的超凈工作臺和實驗室一個鏡頭）
三 、復(fù)蘇細(xì)胞
原理：凍存細(xì)胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必須快速冷凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，致使細(xì)胞死亡。在凍存細(xì)胞的保存管中含有對細(xì)胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應(yīng)馬上將其去除。在冷凍活化前應(yīng)在無菌臺上將細(xì)胞培養(yǎng)液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37℃的溫水中快速使細(xì)胞解凍。解凍后懸液快速移入培養(yǎng)液中混勻，離心去掉上清液，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液。
材料：凍存的Hela細(xì)胞
器材：帶塞培養(yǎng)瓶、離心管（3只）、膠頭滴管（3只）、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、離心機、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱
藥品：RPMI l640培養(yǎng)液、小牛血清、酒精
鏡頭一：細(xì)胞解凍與活化（每一步為一個鏡頭）
實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭實驗臺
（1）取一離心管用滴管在其內(nèi)滴加5--9ml培養(yǎng)液。                                                                                            
（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入上述離心管中。
（4）低速離心(1200r／min) 6min，去上清后再用5--9ml培養(yǎng)液再清洗離心一次。
鏡頭二：裝瓶培養(yǎng)
（1）離心后去掉上清液，在離心管中滴加內(nèi)滴加3ml培養(yǎng)液（RPMI-1640），混勻。#p#分頁標(biāo)題#e#
（2）將離心管中的混合液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)瓶中滴加15滴小牛血清（是小牛血清為10%的濃度），蓋上瓶蓋，將培養(yǎng)瓶平放，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 
四、傳代培養(yǎng)及其操作步驟
原理：細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，為使其生長狀況與其在體內(nèi)生長狀況相似，必須在體外模擬體內(nèi)生長的環(huán)境條件。一是提供細(xì)胞存活的必須條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其他相關(guān)的生長因子，還需要氧氣、適宜的溫度、適宜的酸堿度、適宜的滲透壓，動物細(xì)胞還要加入適宜的血清。
當(dāng)觀察到培養(yǎng)瓶中細(xì)胞鋪滿度為90%時（細(xì)胞生長處于對數(shù)期時），解凍復(fù)活成功后的細(xì)胞要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞細(xì)胞株的**大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。
材料：培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)期的Hela細(xì)胞
器材：帶塞培養(yǎng)瓶2—3個、離心管（3只）、膠頭滴管（3只）、彎頭滴管、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、離心機、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡
藥品：RPMI l640培養(yǎng)液、0.2%胰蛋白酶液、小牛血清、酒精
 
鏡頭一：制細(xì)胞懸液
（1）試驗臺的消毒工作準(zhǔn)備好，盡量吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，以免剩余培養(yǎng)液影響胰蛋白酶活性。
（此處消毒同上，消毒步驟可省略不拍，以配音的方式說明在實驗前已進(jìn)行試驗臺的消毒，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的換液再次可以做一個說明示范）
（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液1ml，置于37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，1--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。
（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)用滴管加入培養(yǎng)液少量，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再少量含血清的加培養(yǎng)液（要加多少？）。
（5）使用吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細(xì)胞。
（6）將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，離心(1200r／min) 6min
注意事項：
掌握好細(xì)胞消化的時間，消化時間過短時，細(xì)胞不易從瓶壁脫落，過長的消化會導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷。若細(xì)胞沒有脫壁，生長良好，則直接倒掉消化液，加培養(yǎng)液5--9ml，離心收集細(xì)胞；若發(fā)現(xiàn)很多細(xì)胞已解離已脫壁（即解離過度），則直接加培養(yǎng)液進(jìn)行離心收集細(xì)胞。
掌握好消化濃度，當(dāng)消化液濃度過高時，消化時間應(yīng)縮短，過低時細(xì)胞消化時間相對延長。
 
鏡頭二：細(xì)胞分裝
（1）將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養(yǎng)液，并反復(fù)吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。
（2）取3個無菌培養(yǎng)瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過火消毒。
（3）在培養(yǎng)瓶中各加入1ml細(xì)胞懸液、2ml培養(yǎng)液（用移液槍）、15滴小牛血清，加好后酒精燈下過火加塞。
細(xì)胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應(yīng)換一次生長液。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。
五 、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存
原理：細(xì)胞的凍存**常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護劑緩慢的冷凍細(xì)胞。由于細(xì)胞在不加任何保護劑的情況之下，細(xì)胞內(nèi)外水分會很快結(jié)成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度升高，PH值改變，部分蛋白質(zhì)因此變性使細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞。因此在細(xì)胞凍存時的關(guān)鍵是盡可能減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，故凍存時采用甘油或DMSO做保護劑，這兩種物質(zhì)分子量較小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可使冰點下降，提高細(xì)胞膜對水的通透性，對細(xì)胞毒害作用小，梯度慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)水分滲出細(xì)胞外，減少形成冰晶對細(xì)胞產(chǎn)生的傷害。
細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。
材料：培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)期的Hela細(xì)胞
器材：帶塞培養(yǎng)瓶2—3個、離心管（3只）、無菌凍存管、膠頭滴管（3只）、彎頭滴管、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、離心機、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱
藥品：RPMI l640培養(yǎng)液、0.2%胰蛋白酶液、10%DMSO、小牛血清、酒精、液氮瓶
鏡頭一：細(xì)胞懸液的制作
（1）選對數(shù)增生期細(xì)胞(細(xì)胞鋪滿度為90%左右時)，在凍存前1d換液。
（2）試驗臺的消毒工作準(zhǔn)備好，吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
（3）向瓶內(nèi)加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。
（4）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，2--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清，終止消化。#p#分頁標(biāo)題#e#
（6）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細(xì)胞，按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)左右密度
（7）將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，(1200r／min) 6min，去掉上清液。
鏡頭二：凍存
（1）配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液（培養(yǎng)液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml），于離心管中加入1ml凍存液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，一個培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞只加入一個凍存管。
（2）將細(xì)胞懸液分裝入無菌凍存管中，每管1～1.5 ml（凍存液要先預(yù)冷到4℃ ）；在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者。
（3）凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增**-5℃～-10℃/ min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入液氮氣中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。
操作時應(yīng)戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。